余 瓊 ，張 巍 ，楊旭升 ，杜 陽(yáng)

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080；2.黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001）

目前，植物病害防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)中做出了巨大貢獻(xiàn)[1]，但化學(xué)農(nóng)藥的普遍使用和農(nóng)藥用量的增加產(chǎn)生了一系列問(wèn)題，如病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題。這些問(wèn)題增加了農(nóng)田生產(chǎn)成本，同時(shí)也使本身具有優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品因農(nóng)藥的過(guò)度使用而受影響。新的防治技術(shù)和病害防治手段成為植?？萍脊ぷ髡咛剿鞯姆较颍渲欣每莶菅挎邨U菌防治植物病害成為研究熱點(diǎn)[2]。枯草芽孢桿菌是一種有益的土壤細(xì)菌，具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。枯草芽孢桿菌對(duì)多種病原菌具有拮抗性能，生產(chǎn)中用于防治多種植物病害[3-5]。例如用來(lái)防治芒果軟腐病、辣椒炭疽病、蘋(píng)果輪紋病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病和一些鐮刀菌引起的病害，相關(guān)研究比較深入，取得了顯著的研究進(jìn)展[6-10]。

由于生防微生物在田間條件下易受土壤溫濕度、pH值、作物生長(zhǎng)狀況及土壤生態(tài)系統(tǒng)等微環(huán)境因素的影響，防治效果不穩(wěn)定，用于大面積推廣應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)太大。因此，大多數(shù)枯草芽孢桿菌的生防研究總體上還處于實(shí)驗(yàn)室階段[11-16]。為了解決這一問(wèn)題，目前主要采用與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配防病和與其他拮抗微生物協(xié)同防病這兩種措施。

與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配防病是通過(guò)使用化學(xué)藥劑來(lái)幫助枯草芽孢桿菌克服在土壤生態(tài)環(huán)境里定殖的過(guò)程中與其它微生物群落競(jìng)爭(zhēng)，從而形成優(yōu)勢(shì)種群，使之有足夠的群體數(shù)量來(lái)克服包括病原菌在內(nèi)的土壤習(xí)居微生物的排斥，保持其在植物根、葉周?chē)ㄖ?、分泌抗生素、誘導(dǎo)植物抗病性等作用，同時(shí)發(fā)揮化學(xué)藥劑殺蟲(chóng)抑菌速度快、防治效果穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)復(fù)配協(xié)同作用達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、用量減少、防效增強(qiáng)的目的[16-21]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和蟲(chóng)源

枯草芽孢桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

供試的蟲(chóng)種為菜青蟲(chóng)，黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心室內(nèi)常年累代飼養(yǎng)多代敏感蟲(chóng)種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（蛋白胨10%，酵母浸粉5%，NaCl 5%，蒸餾水，pH值自然）。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖1%，蛋白胨1%,磷酸氫二鈉0.2%，磷酸二氫鈉0.2%，pH 7.0。

1.3 菌種活化

將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。

1.4 種子液的制備

取一環(huán)活化的菌種，接入裝量為50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，180 r/min培養(yǎng)18h。

1.5 搖瓶培養(yǎng)

取1 mL種子液，接入盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的200mL三角瓶中（接種量為2%,V/V）。置搖床中，30℃振蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速為160 r/min，進(jìn)行發(fā)酵。

1.6 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取培養(yǎng)好的斜面，用接種環(huán)挑3環(huán)接種于盛有50mL無(wú)菌種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件振蕩培養(yǎng)24h。自接種后每2h取樣1次測(cè)定菌液的OD(600 nm),用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.7 殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

取發(fā)酵液10 mL進(jìn)行殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，再用稀HCl或稀NaOH將其 pH值調(diào)至 2.0，3.5，4.0，5.0，6.5，8.0，9.5，11.0，靜置24 h后，再調(diào)pH值為原發(fā)酵液的pH值6.8后，進(jìn)行殺蟲(chóng)活性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

生長(zhǎng)曲線圖見(jiàn)1，發(fā)酵培養(yǎng)0～2 h為枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)停滯期，細(xì)菌數(shù)量極少;自2h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量急劇增多;在12h達(dá)到生長(zhǎng)高峰期，8～12h為枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)緩慢。自12h后細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始減少，枯草芽孢桿菌進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。因此，采用8～12h時(shí)的菌液作為菌種較合適，此時(shí)枯草芽孢桿菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，既可保持高的細(xì)胞活力，又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。

圖1 枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 殺蟲(chóng)活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

枯草芽孢桿菌發(fā)酵液在pH值為2.0～11.0的條件下處理24 h后，進(jìn)行殺蟲(chóng)性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵液經(jīng)過(guò)不同pH值條件下處理后的殺蟲(chóng)活性對(duì)比表Table 1 Comparison of insecticidal activity of broth on different pH valueconditions

2.3 討論

研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的殺蟲(chóng)作用主要有兩種方式，一是造成細(xì)胞畸形，出現(xiàn)囊泡、腫脹，繼而崩潰融解。二是對(duì)細(xì)胞壁的破壞，造成原生質(zhì)從細(xì)胞壁融解處泄漏，以至消融。

3 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出枯草芽孢桿菌在不同的時(shí)間處在不同的生長(zhǎng)時(shí)期，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析得出枯草芽孢桿菌在8～12h為生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)緩慢。自12h后細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始減少，枯草芽孢桿菌進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。因此，采用8～12 h時(shí)的菌液作為菌種較合適，此時(shí)枯草芽孢桿菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，既可保持高的細(xì)胞活力，又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出經(jīng)不同的pH條件處理后，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的殺蟲(chóng)活性在64.7%～73.8%之間波動(dòng)，整體波動(dòng)不大；在pH 3.5～8.0的范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的殺蟲(chóng)活性穩(wěn)定在70%以上，在pH2.0、9.5及11.0處理后菜青蟲(chóng)的死亡率有所下降，但與原發(fā)酵提取液相比，仍保留原發(fā)酵液80%左右活性。說(shuō)明該殺蟲(chóng)活性物質(zhì)具有較好的pH值穩(wěn)定性。

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