倪 林， 李春葆， 李世艷， 胡士明， 葉 明

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.恰恰食品股份有限公司，安徽 合肥 230031；3.安徽九牛飼料有限公司，安徽 合肥 230031）

纖維素是地球上最豐富的自然資源，也是一種可再生的能源物質(zhì)，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化成多種低分子物質(zhì)。為了更好地利用纖維素，國(guó)內(nèi)外學(xué)者很早就開始關(guān)注纖維素酶的研究與應(yīng)用［1］。然而，目前用于纖維素酶生產(chǎn)的菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶活均不高，不能滿足生產(chǎn)實(shí)踐的需要，如芽孢桿菌的CMCase酶活最高達(dá)14.59μmol／min［2］。因此，篩選高效纖維素分解菌，確立相應(yīng)的纖維素酶發(fā)酵工藝條件顯得尤為重要。本研究在廣泛搜集實(shí)驗(yàn)材料的基礎(chǔ)上，希望能分離篩選一株出高產(chǎn)纖維素酶菌株，再對(duì)其進(jìn)行微波－硫酸二乙酯復(fù)合誘變，并運(yùn)用正交試驗(yàn)法對(duì)突變菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件研究，以期為纖維素酶的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

分離自合肥工業(yè)大學(xué)南區(qū)排污口土壤。

1.2 培養(yǎng)基

初篩平板培養(yǎng)基和CMC－Na復(fù)篩培養(yǎng)基［3－4］。其營(yíng)養(yǎng)鹽固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為：不同發(fā)酵底物（稻草粉、稻殼粉、麩皮和濾紙粉）15g，加入營(yíng)養(yǎng)鹽溶液的組成為：（NH4）2SO410g／L、KH2PO43g／L、CaCl20.5g／L、MgSO40.5g／L。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離篩選

以初篩分離培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，CMC－Na培養(yǎng)基和剛果紅染色復(fù)篩。

1.3.2 菌株的鑒定

依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《細(xì)菌和放線菌的鑒定》進(jìn)行初步鑒定。

1.3.3 誘變選育

（1）微波－硫酸二乙酯復(fù)合誘變。參見文獻(xiàn)［5］所述方法制備菌懸液，調(diào)微波爐功率為700W，脈沖頻率為450MHz。按0、10、20、30、40、50、60s不同的處理時(shí)間，對(duì)孢子懸液進(jìn)行處理，然后取出1mL進(jìn)行適當(dāng)稀釋，得到不同稀釋度的菌懸液。稀釋后吸取0.1mL菌懸液涂布于均勻涂有硫酸二乙酯的CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4d。挑取誘變后長(zhǎng)勢(shì)較好的突變菌落，分別接種到CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)4d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)對(duì)照平板上的菌落數(shù)，計(jì)算不同處理時(shí)間的致死率為：

通過測(cè)定透明圈與菌落直徑大小進(jìn)行復(fù)篩，從中挑選高產(chǎn)菌株。

（2）菌株復(fù)篩。挑取初篩得到的產(chǎn)酶菌株斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基上，用無菌玻璃棒壓碎與培養(yǎng)基攪勻，28℃恒溫培養(yǎng)3d后進(jìn)行酶活測(cè)定，突變株與對(duì)照菌株比較，相對(duì)酶活≤90%的為負(fù)突變株，相對(duì)酶活≥110%的為正突變株，相對(duì)酶活在90%～110%的為等性突變株，計(jì)算正突變率。

1.3.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定本次正交試驗(yàn)的因素和水平。以L16（45）正交表來設(shè)計(jì)試驗(yàn)，不考慮各因素間的交互作用，因素水平見表1所列。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

按固體取干重的10倍加入蒸餾水?dāng)嚢?，?0 ℃ 水浴中保溫 45min。4000r／min 離心20min，上清液即為粗酶液，測(cè)定其CMC酶活、天然纖維素酶活和FPA酶活。

1.3.5 纖維素酶活力測(cè)定

（1）CMC酶活的測(cè)定。于25mL具塞試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、pH值為4.8的CMCNa－醋酸緩沖液1.8mL，加入0.2mL酶液，50℃保溫30min后，加入3.0mL DNS試劑，水浴煮沸5min，冷卻后用蒸餾水定容，搖勻，于540nm處測(cè)定吸光度值［2］。

（2）天然纖維素酶活的測(cè)定。于25mL具塞試管中加入pH值為4.8的醋酸緩沖液1.8mL、天然纖維素50.0mg以及酶液0.2mL，50℃保溫24h后，其他的同CMC酶活的測(cè)定［6］。

（3）FPA酶活的測(cè)定。于25mL具塞試管中加入pH值為4.8的醋酸緩沖液1.8mL、50.0 mg新華濾紙以及酶液0.2mL，50℃保溫60min后，其他的同CMC酶活的測(cè)定［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

XWC8菌株的菌落呈圓環(huán)形生長(zhǎng)，放射狀，中間稍隆起，顏色正反面不一致，正面為白色，反面為棕黃色，有土腥味。菌絲有基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的分化，氣生菌絲較細(xì) （直徑為0.8～1.0μm），無分隔多分枝，革蘭氏染色陽性；孢子絲螺旋形，孢子球形（直徑為0.7μm），無孢囊，形成孢子后覆蓋菌落表層呈粉狀，雪白色單個(gè)孢子球形，無鞭毛。氣生菌絲體白色，絲絨狀，在菌落邊緣生長(zhǎng)成同心圓，在以纖維素為基質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。根據(jù)細(xì)菌和放線菌的鑒定手冊(cè)初步確定菌株XWC8屬于放線菌屬（Actinomyces）。

2.2 微波－硫酸二乙酯復(fù)合誘變

取0.1mL誘變后的菌懸液，涂布于均勻涂有硫酸二乙酯的CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4d，誘變致死率曲線如圖1所示。

從圖1可看出，當(dāng)誘變劑量一定時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，孢子的死亡率逐漸升高，微波處理50s，致死率達(dá)98.1%，處理60s時(shí)孢子致死率高達(dá)99.2%。這說明XWC8的孢子對(duì)微波－硫酸二乙酯較敏感。

2.3 纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選

測(cè)定CMC－Na復(fù)篩平板上透明圈與菌落直徑大小，并計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果見表2所列。

表2 突變菌株的CMC－Na相對(duì)酶活

隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，正突變率突變株也隨之增加。當(dāng)輻射時(shí)間為40s時(shí)正突變率最高，達(dá)47.2%。這可能是由于被微波輻射極性分子在電磁場(chǎng)中快速轉(zhuǎn)向產(chǎn)生相互摩擦，引起胞子懸浮液溫度迅速升高；輻射超過50s，孢子的致死率高達(dá)98.1%，且正突變率迅速下降。XWC8－d的CMC－Na相對(duì)酶活為0.920cm／d，較原始菌株XWC8提高了47.2%，因此以XWC8－d作為下一步產(chǎn)酶優(yōu)化的出發(fā)菌株。

2.4 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于試驗(yàn)結(jié)果為多種酶活，而實(shí)際應(yīng)用中各酶活重要性相當(dāng)，所以采用綜合評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的隸屬度，繼而相加得到綜合分，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為單指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表3所列。

根據(jù)極差R值及Ki可得最優(yōu)組合為A3B1C1D1E1，且誘變菌株XWC8－d產(chǎn)纖維素酶的最顯著影響因素為碳源，其次為培養(yǎng)溫度，含水量、培養(yǎng)時(shí)間及氮源影響依次減小。最佳固態(tài)發(fā)酵底物為麩皮，培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)產(chǎn)酶酶活最高，產(chǎn)酶最佳固液比為1∶2.3，最佳培養(yǎng)時(shí)間為96h，氮源硝酸銨對(duì)產(chǎn)酶也有促進(jìn)作用，當(dāng)以硝酸銨為氮源時(shí)，產(chǎn)酶酶活達(dá)到最大，且硝酸銨為無機(jī)氮源較為經(jīng)濟(jì)。

而由表3可看出，最優(yōu)處理組合為A3B2C4D3E1，這與綜合評(píng)分法所得的結(jié)果不一致，故需進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

表3 XWC8－d菌株正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)2組合方案A3B2C4D3E1和A3B1C1D1E1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4所列。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 μmol／min

由表4可知，組合方案A3B1C1D1E1總體上優(yōu)于A3B2C4D3E1，故得到菌株XWC8－d的最佳產(chǎn)酶條件如下：麥麩為單一碳源，NH4NO3為氮源，固液比為1∶2.3，28℃下培養(yǎng)96h。比較突變菌株XWC8－d在該條件下和出發(fā)菌株XWC8在秸稈為單一碳源，硫酸銨作氮源［8］，固液比為1∶2.3，28℃下培養(yǎng)96h條件下的FPA酶活、天然纖維素酶活和CMC酶活，結(jié)果見表5所列。

表5 XWC8－d與XWC8在優(yōu)化條件下的酶活 μmol／min

由表5可知，在優(yōu)化條件下突變株XWC8－d的FPA酶活較原始菌株XWC8提高96.8%，CMC酶活提高102%，天然纖維素酶活提高189%。

3 結(jié)束語

目前，在國(guó)內(nèi)關(guān)于放線菌分解纖維素的報(bào)道不多，本研究對(duì)篩選出的一株可分解纖維素的放線菌XWC8，首次進(jìn)行了微波－硫酸二乙酯復(fù)合誘變，獲得突變株XWC8－d，并運(yùn)用正交試驗(yàn)法對(duì)XWC8－d進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件研究，確定了菌株XWC8－d的最優(yōu)產(chǎn)酶條件如下：碳源麥麩（15g），氮源為NH4NO3（0.3g），固液比為1∶2.3，25℃下培養(yǎng)96h。結(jié)果表明，XWC8－d生長(zhǎng)的最適碳源為小麥加工的副產(chǎn)品麥麩。此外，該菌株還能夠很好地利用稻草和稻殼等秸稈纖維素，并將其降解為多種低分子物質(zhì)，故該菌株具有良好的應(yīng)用前景。

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