冉 云 鄧 欣 楊大國 吳其愷 劉成海 陶艷艷 聶 廣

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2010級博士班 (湖北 武漢，430065) 2.深圳市第三人民醫(yī)院 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所

人肝癌HepG2細胞株能夠穩(wěn)定高表達甲胎蛋白(AFP)［1］，AFP作為腫瘤標(biāo)志物，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為進一步探討AFP的作用機制，我們采用RNAi技術(shù)構(gòu)建不表達或少表達AFP的HepG2模型細胞株?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SiRNA由英俊公司合成，pll 3.7載體由上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司提供，Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)購自大連寶生物公司，293T細胞株購自中科院上海細胞所，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、限制性內(nèi)切酶均購自Invitrogen公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自Axygen公司，凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，ladder購自Fermentas，PCR引物由大連寶生物公司設(shè)計合成，AFP一抗購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA干擾靶點的選擇 靶點序列通過https：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/網(wǎng)站軟件設(shè)計，由英俊公司合成。模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5'端添加T，與BbsI酶切后形成的粘端互補;反義鏈模板的5'端添加AGCT，與XhoI酶切后形成的粘端互補。正義鏈：5'-T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTC-3'，反義鏈：3'-A(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAAGAGCT-5'。按此規(guī)則選擇干擾靶 點 為：AFP-639：5'TGGTCTATCTCCAAATCTAAACTTCAAGAGTTTAGATTTGGAGATAACCTT TTTTC3';3'ACCAGATAGAAATTTGAAGTTCTCTCAAATCTAAACCTCTATCTGG AAAAAAGAGCT5'。

1.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建 取oligo溶液5ul，在PCR儀上處理后得到濃度為10 μM的 shRNA模板，將所得模板溶液稀釋為200nM，用于連接反應(yīng)。取 pPll3.7載體 10ug，10×Buffer R10ul，XhoI酶 5ul，Hpa I酶 2ul，加雙蒸水至 100ul體系，37℃酶切1小時，瓊脂糖電泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0(TaKaRa) 回收。按 10×T4 Ligation Buffer 2ul，pll 3.7(XhoI+Hpa I)，shDNA template(100nM)，T4 DNA ligase各1ul，加水至20ul，22℃反應(yīng)1小時后轉(zhuǎn)染JM 109 competent cells進行連接反應(yīng)，每個連接反應(yīng)挑取5個菌落，接種到含50 ug/ml Ampicillin的LB培養(yǎng)集中，使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒分別用Xba I和Nhe I進行雙酶切鑒定，并進行測序鑒定。

1.2.3 病毒載體的包裝與純化 制備慢病毒包裝系統(tǒng)中4種質(zhì)粒DNA溶液，當(dāng)293 T細胞密度達60%～70%時將DNA和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細胞的培養(yǎng)液中混勻，培養(yǎng)12小時后棄去培養(yǎng)液，加PBS 15 ml輕搖后棄去，重復(fù)該步驟3次，加入含100 ml/L小牛血清的細胞培養(yǎng)液15ml，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，收集細胞上清液，將上清液4℃、4000g離心10分鐘，收集上清液并以0.45 μm濾器過濾后，4℃、25000 r/min離心20分鐘，棄上清液，用500ul PBS重懸病毒沉淀于4℃保存過夜。

1.2.4 HepG2細胞病毒轉(zhuǎn)染 六孔板接種細胞，感染實驗分為空白對照組、陽性質(zhì)控組、模型細胞組 (AFP-639)，細胞換液，吸棄培養(yǎng)基，分別添加1.0ml含2%FBS、不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液;同時加入病毒粗提液500ul，24小時后棄上清液，換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察細胞，拍片。繼續(xù)培養(yǎng)96小時后，收集細胞，抽提RNA和蛋白。RT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞 (模型細胞)內(nèi)AFP基因及蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒用Xba I和Nhe I進行雙酶切鑒定結(jié)果 見圖1。

圖1 質(zhì)粒用XbaI和NheI雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 測序鑒定結(jié)果 見圖2。

圖2 測序鑒定結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染后大量HepG2細胞呈現(xiàn)綠色熒光 見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后鏡下所見HepG2細胞

2.4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞內(nèi)AFP基因表達情況

見圖4。如圖，與正常組NI組 (野生型HepG2細胞)比較，干擾后模型細胞AFP基因的表達顯著減少，顯著抑制了AFP基因表達。

圖4 RT-RCP檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞內(nèi)AFP基因表達

2.5 實時熒光定量PCR檢測模型細胞及其傳代后細胞內(nèi)AFP基因表達 結(jié)果見表1。

表1 模型細胞AFP基因表達結(jié)果比較(±s)

表1 模型細胞AFP基因表達結(jié)果比較(±s)

與野生HepG2組比較，*P＜0.01，與M1組比較，#P＞0.05

組別 AFP/β-actin野生HepG2組1±0 M1(細胞傳1代) 0.157±0.025*M5(細胞傳5 代) 0.167 ±0.015*#

2.6 Western blot檢測模型細胞及其傳代后細胞內(nèi)AFP蛋白表達結(jié)果 見表2、圖5。

表2 模型細胞內(nèi)AFP蛋白表達結(jié)果比較(±s)

表2 模型細胞內(nèi)AFP蛋白表達結(jié)果比較(±s)

與野生HepG2組比較，*P＜0.01，與M1組比較，#P＞0.05

組別AFP/GAPDH野生HepG2組1.38 ±0.025 M1(細胞傳1 代) 0.24 ±0.119*M5(細胞傳5 代) 0.22 ±0.023*#

圖5 傳代后細胞內(nèi)AFP表達結(jié)果

3 討論

RNAi是由作用于同源序列mRNA的雙鏈RNA所介導(dǎo)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制［2］;具有費用低廉、抑制效率高、容易篩選靶序列等特點，克服了以往反義核酸技術(shù)代價高昂、靶序列篩選困難等缺點［3］。siRNA表達載體有質(zhì)粒表達載體和病毒表達載體兩種，目前普遍認為腺病毒載體是一種高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)染載體［4］。當(dāng)前在國內(nèi)有一些關(guān)于靶向AFP基因干擾的相關(guān)報道，或是構(gòu)建干擾質(zhì)粒［5］，或是觀察RNA干擾對肝癌細胞的影響［6］，但到目前為止還沒有關(guān)于靶向AFP基因干擾構(gòu)建不表達或少表達AFP的人肝癌HepG2細胞株的報道。在本研究中，我們通過軟件設(shè)計了4個靶序列，腺病毒少量包裝轉(zhuǎn)染后檢測AFP基因及蛋白的表達，靶點“639”干擾效率最高，故選此干擾靶點構(gòu)建細胞模型。此細胞模型傳代后仍能穩(wěn)定地沉默AFP表達，為進一步對AFP進行機制研究和藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］BOIS-JOYEUX B，THOMASSIN H，RICHARD F，et al.Several transcription factors participate in the functioning of the alpha-fetoprotein gene promoter［J］.Bull Cancer，1995，82(7)：541-550.

［2］AGRAWAL N，DASARADHI P V，MOHMMED A，et al.RNA interference：biology，mechanism，and applications［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2003，67(4)：657-85.

［3］HARBORTH J，ELBASHIR SM，VANDENBURGH K，et al.Sequence，chemical，and structural variati-on of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing［J］.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2003，13(2)：83-105.

［4］VORBURGER SA，HUNT KK.Adenoviral gene therapy［J］.Oncologist，2002，7(1)：46-59.

［5］亓同鋼，汪運山，王芳，等.AFP基因SiRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，42(3)：353-354，358.

［6］張國英，楊慧，劉明社，等.RNA干擾抑制HepG2細胞AFP基因表達實驗方法建立［J］.長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，20(4)：241-243.