孟忠吉 張永紅 李 東 柯昌征 湯守兵 陳 悅△

1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院感染科 2.生物醫(yī)學研究所 (湖北十堰，442000)

人體感染HBV后，病毒、人體的免疫應答和肝細胞三者相互作用，共同影響著乙型肝炎的病程進展和轉(zhuǎn)歸。其中，宿主免疫狀態(tài)是決定乙型肝炎臨床轉(zhuǎn)歸和治療療效的最主要因素［1］。研究表明，慢性肝炎患者體內(nèi)DC免疫指標的下降與HBV感染常同時存在，提示HBV感染慢性化與DC缺陷有關(guān)［2］。本研究探討HBV的病毒粒子和抗原成分對DC細胞成熟和功能的影響，探索HBV相關(guān)DC細胞功能缺陷在乙型肝炎慢性化中的地位。

1 材料與方法

1.1 材料 L929細胞和小鼠腦心肌炎病毒 (EMCV)為本室保存。HBV-Met細胞培養(yǎng)上清 (德國杜伊斯堡-埃森大學醫(yī)學院胃腸肝病科Dr.Wu提供)含HBV病毒粒子和 HBsAg、HBeAg［3］。細菌脂多糖 (LPS)為Invivogen公司產(chǎn)品;重組人粒細胞-單核細胞克隆刺激因子 (rh GM-CSF)和白細胞介素4(rh IL-4)，重組人腫瘤壞死因子-α (TNF-α)為Peprotech公司產(chǎn)品;FITC-標記的抗小鼠CD-Ⅱc，PE-標記的抗小鼠MHCII、CD40、CD80、CD86單克隆抗體購自BD公司。

1.2 DC細胞分離培養(yǎng) 小鼠骨髓來源BM-DC的分離參照文獻［3］進行。分離C57BL/6小鼠的股骨骨髓細胞，制成細胞懸液，PBS洗3遍后，懸浮于RPMI 1640中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時后，棄懸浮細胞，貼壁細胞置于完全DC培養(yǎng)基 (RPMI 1640，10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10 ng/ml rhIL-4，5 ng/mL rhGM-CSF)。

1.3 DC細胞的成熟 DC細胞培養(yǎng)的第7天，加入1μg/mL的LPS，對照組和實驗組在培養(yǎng)基中分別加入HBV-Met細胞培養(yǎng)2天、12天的上清 (HBV-Met d2，HBV-Met d12)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時。分別收集DC細胞和細胞培養(yǎng)上清用于后續(xù)檢測。

1.4 DC細胞的流式細胞儀檢測 收集懸浮的DC細胞，用FACS標記液PBA(PBS+1%BSA+0.02%疊氮鈉)調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，加入離心管，100 μl/管，分別按直接標記法或間接標記法進行標記，流式細胞儀 (FACS calibur，BD公司)檢測細胞表面表型。

1.5 病毒保護實驗 DC細胞上清中的IFN水平采用病毒保護試驗方法檢測［4］。L929細胞以5.5×104/孔接種于 96孔板，加入100ul含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時，使細胞鋪滿孔底。棄上清液，加入100ul RPMI-1640，待檢測的DC細胞上清液以1∶2到1∶256稀釋后加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。把EMCV加入到各孔中，37℃，5%CO2再培養(yǎng)24小時。棄培養(yǎng)基，用含0.1%結(jié)晶紫的20%乙醇固定染色L929細胞。1個單位的IFN定義為保護50%細胞免受病毒攻擊死亡的能力。

1.6 TNF生物活性分析 DC細胞上清中的TNF水平采用生物活性分析方法檢測［5］。L929細胞以5.5×104/孔接種于96孔板，加入100ul含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時，使細胞鋪滿孔底。棄上清液，加入100ul RPMI-1640含有2μg/ml放線菌素D。待檢測的DC細胞上清液以1∶2到1∶256稀釋后加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。棄培養(yǎng)基，用含0.1%結(jié)晶紫的20%乙醇固定染色L929細胞。1個單位的TNF定義為殺死50%L929細胞的能力。

2 結(jié)果

2.1 HBV抑制成熟DC細胞產(chǎn)生IFN的能力 DC細胞在LPS等刺激下成熟后可以產(chǎn)生高水平的I型干擾素，而在培養(yǎng)基中加入含有HBV病毒粒子和HBsAg、HBeAg等成分的細胞培養(yǎng)上清后 (Smet d12)，DC細胞即使同樣受到LPS的刺激，IFN的產(chǎn)量也大幅下降 (圖1)。

圖1 HBV抑制成熟DC細胞產(chǎn)生IFN的能力

2.2 HBV抑制DC細胞表面分子的表達 在DC細胞培養(yǎng)的第7天，DC細胞成熟過程中，使用含HBV的培養(yǎng)基 (Smet d12)，則DC細胞成熟障礙，表面分子表達水平受到顯著抑制，而正常的DC細胞(Smet d2)成熟后高表達CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ (圖2)。

2.3 HBV抑制成熟DC細胞產(chǎn)生TNF的能力 DC細胞在LPS等刺激下成熟后可以產(chǎn)生高水平的TNF，而在培養(yǎng)基中加入含有HBV病毒粒子和HBsAg、HBeAg等成分的細胞培養(yǎng)上清后 (Smet d12)，DC細胞即使同樣受到LPS的刺激，TNF的產(chǎn)量也大幅下降 (圖3)。

圖2 HBV抑制DC細胞表面分子的表達

圖3 HBV抑制DC細胞分泌TNF的能力

3 討論

慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，HBV的抗原成分和病毒粒子直接或間接抑制免疫應答，其中DC細胞數(shù)量減少和功能障礙是造成免疫耐受的重要原因。DC是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞 (APC)，也是唯一能活化初始T細胞的APC，在特異性激活初始T細胞、聯(lián)結(jié)天然免疫和獲得性免疫應答中發(fā)揮獨一無二的作用。DC細胞高表達 Toll樣受體 (TLRs)3、4、7、8、9，相應的配體尤其是 TLR3、4、9的配體 Poly(I:C)、LPS和CpG可以激活相應的TLR通路，誘導DC細胞活化，表現(xiàn)為DC細胞共刺激分子CD80、CD86、CD40和成熟標志MHC-I、MHC-II、CD83的表達上調(diào)，促進DC細胞分泌TNF、IFN等細胞因子，并且可以誘導自體T細胞活化［4］。DC的成熟在免疫應答中具有重要意義，是激活T細胞、啟動免疫應答的必要條件。由于HBV抗原成分抑制DC細胞的成熟和功能活化，導致DC抗原遞呈能力低下。本研究結(jié)果顯示:在DC細胞成熟過程中加入HBV病毒粒子和抗原成分，顯著抑制DC細胞表面共刺激分子和成熟標志的上調(diào)表達，抑制DC細胞分泌IFN和TNF的能力。提示HBV病毒粒子和抗原成分可以直接抑制DC細胞的表型成熟和功能活化，從而使DC細胞不能有效遞呈HBV的抗原給T淋巴細胞，這可能是形成HBV特異性免疫耐受的重要機制。

我們前期的研究顯示HBsAg、HBeAg和HBV顆粒均可以不同程度的抑制肝細胞和肝臟非實質(zhì)細胞以及DC細胞等對于TLR配體的應答能力［5］。另外，HBV DNA多聚酶可以抑制IFN信號通路［6］，HBV可通過前C/C蛋白下調(diào)IFN可誘導的MxA啟動子活性或通過HBx蛋白依賴性的蛋白酶的活性抑制等途徑來拮抗宿主的抗病毒效應機制［7］，更重要的是，新生期的感染可能造成抗原特異性T細胞的中樞缺失或無能。因此，慢性乙肝患者免疫系統(tǒng)不健全、免疫細胞 (T細胞、DC)應答數(shù)量和質(zhì)量上的不足，加上病毒顆粒和抗原的耐受原作用等因素形成HBV特異性免疫耐受，而這種耐受是導致HBV持續(xù)感染和久治不愈的根源。

國內(nèi)外研究者一直在探索打破HBV特異性免疫耐受的方法，目前正在進行研究的免疫調(diào)節(jié)治療包括細胞因子誘導的殺傷細胞 (CIK)［8］、HBV 抗原激活的 DC 疫苗［9］、特異性CTL、HBV多肽疫苗、免疫復合物疫苗等［10］，大多還處于臨床前研究或臨床試驗階段。通過對DC成熟過程的改變來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，可以增強免疫功能，促進慢性乙肝患者病毒控制。我們也開展了DC疫苗和DC-CIK治療乙型肝炎和腫瘤的臨床研究，取得了初步的臨床療效。另一方面，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)特異性siRNA抑制嗜肝病毒基因表達和復制后，可以顯著上調(diào)肝細胞免疫應答基因的表達，增強抗病毒天然免疫功能［11］。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi介導的WHV mRNA降解產(chǎn)物可能通過活化PKR和TLR-3、7/8信號通路，誘導IFN和炎癥因子的產(chǎn)生而活化細胞天然免疫功能。而且，HBV的基因表達和復制被RNAi封閉后，可以解除HBV對于NF-κB、IRF-3以及ERK信號通路的抑制，上調(diào)TLR的表達，恢復細胞對于TLR激動劑的反應性［3］。因此，慢性乙型肝炎的治療應該從抗病毒和調(diào)節(jié)免疫兩個方面入手，一方面封閉病毒蛋白的表達，解除HBV特異性耐受;另一方面激活/恢復天然免疫，輔助增強HBV特異性免疫應答。如何充分上調(diào)DC細胞功能，打破機體的免疫耐受，是亟待解決的問題。

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