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        TopoIIα在胃癌組織中的表達與臨床意義

        2011-08-28 03:23:02李曉燕高天慧李林蔚劉明月
        中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2011年14期
        關(guān)鍵詞:陽性細胞切片沖洗

        李曉燕 高天慧 李林蔚 劉明月

        胃癌是我國最常見腫瘤之一,目前據(jù)Parkin報道其發(fā)生率位居第四位,死亡率僅次于肺癌占第二位[1]。手術(shù)是主要的治療措施,但由于早期診斷率低,大多數(shù)患者失去手術(shù)機會,胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是胃癌治療失敗的主要原因之一[2],因此化療在胃癌治療中處于非常重要的地位。有試驗研究表明:TopoIIα在胃癌組織中的高表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展以及多種抗腫瘤藥物作用機制有關(guān),并且與多藥耐藥有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,檢測了胃癌中TopoIIα的表達,旨在探討其與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系,指導(dǎo)胃癌化療及耐藥。

        1 資料與方法

        1.1 標本 收集河南省人民醫(yī)院病理科2008年10月至2010年10月間89例胃腺癌手術(shù)切除石蠟標本,取20例癌旁正常胃組織作為對照組,原發(fā)性胃癌的組織學(xué)分類標準參照2000年WHO胃癌組織學(xué),均為胃腺癌,根椐2003年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和2010美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制定的TNM分期標準進行臨床分期。

        1.2 儀器與試劑 BP121S型分析天平、病理石蠟切片機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱、醫(yī)用燒烤微波爐、自動染片機、自動脫水機、微量吸管、光學(xué)顯微鏡、鏡下圖像以O(shè)lympus Dp70圖像采集分析儀進行采集、分析。

        TopoIIα(產(chǎn)品編號:MAB-0588),試劑盒選用即用型MaxVision檢測試劑盒,對二甲氨基偶氮苯(DAB)顯色劑,均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。酒精、二甲苯、蘇木素等試劑由河南省人民醫(yī)院病理科提供。

        1.3 試驗方法 ①常規(guī)石蠟標本切片:使用切片機將本研究中所有石蠟包埋標本進行切片,所有切片厚度為3~5 μm;②標本脫蠟至水:脫蠟前標本置于60℃恒溫箱20 min。在二甲苯及梯度乙醇中脫蠟水化(二甲苯10 min×2次,無水酒精5 min×2次、90%酒精5 min×1次、75%酒精5 min×1次);③TopoIIα采用檸檬酸高溫修復(fù),37℃水浴箱內(nèi)孵育30 min;④PBS液沖洗3 min;⑤阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性:H2O2100 ml+CH3OH 900 ml液避光室溫浸泡10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,然后蒸餾水沖洗2 min×1次,PBS沖洗2 min×3次;⑥PBS沖洗3次滴加TopoIIα 40~50 μl,4℃冰箱過夜;⑦冰箱內(nèi)取出標本,PBS沖洗2次,滴加即用型MaxVision檢測試劑40~50 μl,室溫下40 min;⑧DAB顯色:每張切片加兩滴新鮮配制的DAB,在顯微鏡下控制顯色(5~15 min);⑨自來水沖洗;蘇木素復(fù)染30 s,鹽酸酒精分化;自來水沖洗;⑩脫水、透明:95%乙醇5 min×1次;70%乙醇5 min×1次;無水酒精5 min×2次;二甲苯10 min×2次;○11封片:切片干燥后,用中性樹膠封固,干燥后顯微鏡下觀察。

        1.4 結(jié)果判斷 每批實驗均設(shè)陽性和陰性對照,TopoIIα表達陽性可見細胞核有棕黃色顆粒樣沉淀,陰性細胞核無棕黃色顆粒樣沉淀。染色分級整張切片無陽性細胞(-),陽性細胞數(shù)<10%(+),陽性細胞數(shù)10% ~50%(++),陽性細胞數(shù)≥50%(+++)。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 TopoIIα在胃癌中的表達。見圖1,表1。TopoIIα在胃腺癌中的表達為53.9%(48/89)。在正常胃組織中的表達為0%。

        圖1 TopoIIα在胃癌中的表達

        表1 TopoIIα表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(例,%)

        2.2 TopoIIα表達與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系,表1。TopoIIα表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無顯著性相關(guān),而與腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān),且在胃賁門處表達高于胃底部,隨著分化程度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增多及腫瘤分期的增加其TopoIIα的表達增強。

        3 討論

        DNA拓撲異構(gòu)酶(Topo)普遍存在于各類生物種群中,包括病毒、原生動物、真菌、植物、昆蟲、兩棲類、鳥類及哺乳動物的正常和腫瘤細胞中,參與細胞有絲分裂過程中的DNA轉(zhuǎn)錄、重組、復(fù)制及染色體分離[3-4],是調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動態(tài)變化,控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶。DNAToPoll主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮生理作用。TopoII又稱回旋酶,最早發(fā)現(xiàn)于1980年,是與細菌DNA回旋酶(gyrase)具有同源性的二聚體蛋白。人類的 TopoⅡ有兩種同工酶,為 TopoIIα和 TopoIlβ。TopoIIα由17號染色體編碼,TopoIlβ則由3號染色體編碼,兩者均可與DNA形成穩(wěn)定的共價復(fù)合物。TopoIlα大多位于增殖細胞中,而且在快速增殖細胞中的水平是靜止細胞中的數(shù)倍,在細胞內(nèi)主要分布于細胞核漿,并多呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚集在染色體著絲粒周圍[5]。TopoIlα參與 DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制及染色體的分離等過程,主要存在于S2、G2/M期,有兩種功能:一作為細胞的增殖指數(shù),表達于S2、G2/M期;二作為抗癌藥物的靶點指數(shù)。同時研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中,TopoIIα的表達增高是一個普遍現(xiàn)象,而且臨床方面已逐漸將TopoIIα作為判斷細胞或腫瘤增殖程度的一個標志[6-8];并且,許多研究發(fā)現(xiàn) TopoIIα 表達與患者的預(yù)后有關(guān)[9,10]。亦有研究表明,TopoIlα陽性表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。Varis[12]和 Wikman[13]分別發(fā)現(xiàn),在胃癌和肺癌中TopoIlα的增殖比Her-2更常見。

        本研究中TopoIIα的陽性表達率為53.9%,與胃癌的部位有關(guān),胃賁門癌TopoIIα的陽性表達率較高;與胃癌組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌分期相關(guān),低分化者表達顯著高于高中分化,胃癌分期越晚其表達越高,提示組織分化越差,分期越晚,說明其惡性程度高,細胞增殖活躍,存在于S2、G2/M期的TopoIIα量多,陽性率就高,同時也提示耐藥性越低,對化療藥物敏感性高。

        TopoII為靶點的抗癌藥較多,根據(jù)作用方式不同分為嵌入型和非嵌入型兩類。嵌入型抑制劑系通過其分子中類似嘌呤堿或嘧啶堿的多環(huán)結(jié)構(gòu)嵌到TopoⅡ與DNA結(jié)合部位的雙鏈之間,從而干擾了該酶將DNA斷端重新接合的正常功能,并進一步造成DNA鏈斷裂損傷,導(dǎo)致細胞死亡這一類藥物有蔥環(huán)類抗生素如阿霉素,柔紅霉素,放線菌素,米托蒽醌,安吖啶,咔唑類等[14]。非嵌人型抑制劑其作用模式還不十分楚,可能是直接作用TopoⅡ或是僅僅與雙鏈DNA中的一條鏈結(jié)合以影響酶功能。這一類藥物依托泊苷(etoposide),替尼泊苷(teniposide)等。一般認為TopoII陽性表達越高,化療藥物具備的靶點越多,對抗癌藥物敏感性越高。

        TopoⅡ抑制劑引起的由ToPon介導(dǎo)的MDR不典型多藥耐藥(at-MDR)。主要表現(xiàn)在以下幾方面:①TopoIIα基因的位點突變或缺失;②TopoIIα的磷酸化水平提高,已經(jīng)證實,TopoIIα的高磷酸化與它的催化活性及易解離復(fù)合物形成呈負相關(guān);③TopoIIα基因調(diào)控異常導(dǎo)致TopoIIα蛋白水平降低。臨床上對腫瘤細胞的治療中如不了解基因TopoIIα水平,盲目使用抗腫瘤藥,易導(dǎo)致腫瘤細胞抗藥性的產(chǎn)生,影響療效。

        4 小結(jié)

        胃癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段的綜合結(jié)果,本研究發(fā)現(xiàn)TopoIIα與胃癌的部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素有關(guān)。而DNA拓撲酶抑制劑開辟了腫瘤治療的新途徑,其具體療效還需要進一步的臨床試驗研究。TopoⅡ抑制劑引起的由TopoII介導(dǎo)的不典型多藥耐藥(at-MDR)在胃癌的研究中有待于進一步的試驗研究。

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