劉洪濤， 蔡 超， 梁紅艷， 藍紹明， 張君成＊

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004； 2.山東萊蕪煙草有限公司，萊蕪 271100）

毒素在稻紋枯病菌致病中的作用分析

劉洪濤1，2， 蔡 超1， 梁紅艷1， 藍紹明1， 張君成1＊

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004； 2.山東萊蕪煙草有限公司，萊蕪 271100）

用水稻胚根生長抑制法測定了10個稻紋枯病菌菌株在寄主體外產(chǎn)生毒素的能力，發(fā)現(xiàn)不同菌株的產(chǎn)毒能力各不相同，且產(chǎn)毒量差異極顯著。用水稻離體葉接種法測定了這10個菌株的致病力，結(jié)果表明：不同菌株的致病力也各不相同，且差異極顯著。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，菌株的體外產(chǎn)毒能力與致病力高度正相關(guān)（R＝0.915 2）。這些結(jié)果表明：稻紋枯病菌毒素的分泌可能在其致病過程中起重要作用。

稻紋枯病菌； 毒素； 致病作用

由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）侵染引起的稻紋枯病，其發(fā)生危害遍及全球水稻產(chǎn)區(qū)。在國內(nèi)，該病害已經(jīng)發(fā)展成為水稻的首要病害，每年造成的損失高達60億kg［1］。因此，如何有效控防稻紋枯病的發(fā)生發(fā)展，是國內(nèi)外非常關(guān)切的問題。當前對該病害的防治主要限于使用藥劑手段，環(huán)保而有效的手段如抗病品種和生物防治等，還未能在生產(chǎn)上發(fā)揮作用，很重要的一個原因是，對稻紋枯病菌的致病機理及水稻的抗病機理的認識仍然有限。分泌的毒素是病原菌致病的重要機制，已經(jīng)有報道，稻紋枯病菌可產(chǎn)生對水稻有害的毒素［2－4］，國內(nèi)外也對稻紋枯病菌毒素進行了許多有關(guān)研究，但毒素在稻紋枯病菌致病過程中的作用仍然不十分清楚。在進行廣西稻紋枯病菌群體致病力研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一些致病力存在較大差異的菌株，利用這些有利菌株材料，作者對稻紋枯病菌體外培養(yǎng)的產(chǎn)毒能力進行了一些測定分析，以期為深入揭示該病菌的致病機理積累依據(jù)，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

稻紋 枯 病 菌 10 個 菌 株：2008-5-2、2008-9-2、2008-58-1、2008-79-1、2008-97-1、2008-112-2、2008-119-2、2008-136-2、2008-139-2、2008-144-1，全 部 由廣西各地的病害標樣分離獲得。

寄主水稻3個品種：‘粵優(yōu)206’（蘇明天種業(yè)科技有限公司）；‘特優(yōu)524’（廣西龍鋒種業(yè)有限公司）；‘中浙優(yōu)1號’（浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌絲塊準備

將各菌株的保存菌種先轉(zhuǎn)入PSA（馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1 000mL）平板培養(yǎng)活化，待菌落長至平板直徑的3／4時，用6mm打孔器在平板菌落周緣上打取活力一致的瓊脂菌絲圓塊，作為毒素制備的植入菌塊和致病力測定的接種體。

1.2.2 粗毒素的制備

用PS（馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1 000mL）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲取病菌毒素。每三角瓶定量盛裝PS培養(yǎng)液40mL，滅菌后，每瓶PS培養(yǎng)液定量移植入5塊菌絲塊，每菌株培養(yǎng)2瓶，置28℃下恒溫振蕩培養(yǎng)18d。將菌絲培養(yǎng)液經(jīng)2層紗布過濾，合并每菌株的2瓶過濾液并離心（6 000r／min）30min，取離心上清液于121℃蒸汽滅菌15min，滅菌濾液為含毒素的粗提液（簡稱粗毒素）。

1.2.3 菌株產(chǎn)毒能力測定

用生物測定法間接測定菌株體外培養(yǎng)產(chǎn)生粗毒素的能力。選飽滿的‘粵優(yōu)206’水稻種子，用無菌水沖洗3次，播于鋪有兩層濾紙的9cm培養(yǎng)皿中，每皿加入粗毒素液10mL，每處理設(shè)3皿重復(fù)，每重復(fù)30粒種子，以蒸餾水為對照。28℃催芽72h后，取出萌發(fā)種子，量取胚根長和胚芽長。計算粗毒素對胚根（芽）的抑制率，以抑制率的大小間接表示菌株產(chǎn)生毒素能力的高低（總量的多少）。

粗毒素抑制率（%）＝［對照胚根（胚芽）長度－處理胚根（胚芽）長度］／［對照胚根（胚芽）長度］×100。

1.2.4 菌株致病力測定

采用離體葉片接種方法測定菌株的致病力。盆栽水稻品種‘特優(yōu)524’（較抗?。┖汀姓銉?yōu)1號’（較感?。羧?葉期稻苗（從下往上）的第3、4片葉約25cm的葉段，置于玻璃罩小濕箱內(nèi)，葉段的生物學(xué)下端浸入清水中。在葉片的下部置放接種體菌塊，每菌株處理3個小濕箱，每濕箱內(nèi)接種8片葉段，于30℃下保濕培育。40h后測量葉片發(fā)病的病斑長度（接種點到最前沿病斑的距離），以病斑長度的多少表示致病力的強弱。

1.2.5 產(chǎn)毒素能力與致病力的相關(guān)性分析

將粗毒素對種子胚根（芽）生長的抑制率與相應(yīng)的菌株的致病力進行相關(guān)性統(tǒng)計，分析菌株產(chǎn)毒能力與致病力的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 各菌株的產(chǎn)毒能力

稻紋枯病菌粗毒素對胚根生長具有明顯的抑制作用，而對胚芽生長的抑制作用不明顯。經(jīng)比較，10個菌株的產(chǎn)毒能力存在顯著差異，抑制作用最高的菌株2008-139-2約是最低者2008-97-1的2倍（表1）。

表1 各菌株的粗毒素對水稻胚根和胚芽生長的影響1）

2.2 各菌株的致病力

在兩個品種上，10個菌株間的致病力均存在極顯著的差異，在品種‘中浙優(yōu)1號’上，致病力最強和最弱的菌株引起病斑長度分別為4.79cm和0.54cm；在品種‘特優(yōu)524’上，致病力最強和最弱的菌株引起病斑長度分別為3.72cm和0.1cm（表2）。10個菌株的致病力在這兩個品種上的致病力強弱變化趨勢一致；在品種‘中浙優(yōu)1號’上病斑長度平均為2.7cm，在‘特優(yōu)524’上病斑長度平均為2.01cm，經(jīng)統(tǒng)計，兩者間差異極顯著。

表2 各菌株在2個品種上的致病表現(xiàn)1）

2.3 菌株的產(chǎn)毒能力與致病力的關(guān)系

相關(guān)分析表明，各菌株的粗毒素對胚根的抑制率與在品種‘中浙優(yōu)1號’上的病斑長度的相關(guān)系數(shù)為0.912 9，與在品種‘特優(yōu)524’上的病斑長度的相關(guān)系數(shù)為0.913 4，與在2個品種上綜合表現(xiàn)（平均病斑長度）的相關(guān)系數(shù)為0.915 2；這3對數(shù)據(jù)的相關(guān) 性 均 達 到 極 顯 著 水 平 （R0.05＝0.632，R0.01＝0.765），因此，菌株致病力與其體外產(chǎn)毒能力具正相關(guān)關(guān)系，體外產(chǎn)毒能力越強，菌株致病力越強。

3 討論

在毒素生物測定中，同樣毒素處理濃度下，胚根生長受到明顯抑制，而胚芽生長未受到影響，表明萌發(fā)的水稻種子，胚根比胚芽對毒素更為敏感，結(jié)果與徐敬友等的報道一致［5］。因此，生物測定時，采用抑制胚根生長法更為理想。

稻紋枯病菌可產(chǎn)生多種對水稻有害的毒素［2－4］，但該病菌在寄主水稻上產(chǎn)生毒素的確切種類及數(shù)量至今依然不清楚。毒素對水稻的作用實際是病菌分泌的所有毒素的綜合效應(yīng)，因而從毒素方面研究病菌與寄主的互作，所用毒素的種類和數(shù)量應(yīng)與病菌在寄主水稻產(chǎn)生的毒素種類和數(shù)量一致，因此，在有關(guān)研究中，采用培養(yǎng)產(chǎn)物的毒素混合物比用提純單一的毒素，可能更為接近病菌在寄主上分泌毒素的組分狀態(tài)。Brooks在進行水稻對毒素的敏感性遺傳研究中，使用的毒素是培養(yǎng)產(chǎn)物的混合液［6］。

許多報道采用Richard組合培養(yǎng)基培養(yǎng)制備稻紋枯病菌毒素［4－5，7］，該培養(yǎng)基營養(yǎng)成分簡單，用于毒素的分離提純研究可能存在優(yōu)勢，但該培養(yǎng)基組分與水稻組織組分有較大的差異，用其培養(yǎng)病菌獲得的毒素的種類及數(shù)量與該病菌在水稻上產(chǎn)生的毒素種類及數(shù)量可能有不小的差異，相比之下，植物組織與水稻組織的營養(yǎng)成分更為相似，因而要獲得接近病菌在寄主上的毒素分泌狀態(tài)，用含天然植物組織的培養(yǎng)基可能更為可靠，因此本研究用PS培養(yǎng)基進行毒素的培養(yǎng)制備。Brooks在進行水稻對毒素的敏感性遺傳研究時，直接用稻葉培養(yǎng)基來培養(yǎng)制備毒素［6］。

對水稻紋枯病菌的致病機理雖有不少研究，但某些結(jié)論并不一致。Bateman提出，果膠酶是立枯絲核菌的致病因子，該菌的致病力與其所產(chǎn)生的果膠酶活性有關(guān)［8］；但Sriram等卻認為，稻紋枯病菌致病性與果膠酶活性無關(guān)，而與病菌產(chǎn)生的毒素有密切關(guān)系［9］；而Lakpale等認為稻紋枯病菌產(chǎn)生的毒素在致病過程中不起主要作用［3］。本試驗結(jié)果顯示，稻紋枯病菌在體外產(chǎn)生毒素的能力與致病力極顯著相關(guān)，結(jié)果與 Vidhyasekaran等［4］和徐敬友等［5］研究的結(jié)果一致，表明毒素可能在稻紋枯病菌致病過程中起著很重要的作用。不過，由于病原菌在寄主體外與在寄主體內(nèi)產(chǎn)生毒素的情況可能并不完全一致，因此，要清楚揭示毒素在致病過程中的作用仍需要深入研究。

［1］ 王艷青.近年來中國水稻病蟲害發(fā)生及趨勢分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（2）：343-347.

［2］ Akoi H，Sassa T，Tamura T.Phytotoxic metabolites ofRhizoctonia solani［J］.Nature，1963，200：575.

［3］ Lakpale N，Rajiv Kumar，Khare N.Studies on toxin produced byRhizoctonia solanicausing sheath blight of rice［J］.Indian Journal of Mycology and Plant Pathology，1996，26（3）：263-265.

［4］ Vidhyasekaran P，Ruby Ponmalar T，Samiyappan R，et al.Host-specific toxin production byRhizoctonia solani，the rice sheath blight pathogen［J］.Phytopathology，1997，87（12）：1258-1263.

［5］ 徐敬友，張華東，張紅，等.立枯絲核菌毒素的產(chǎn)生及與致病力的關(guān)系［J］.揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2004，25（2）：61-64.

［6］ Brooks S A.Sensitivity to a phytotoxin fromRhizoctonia solanicorrelates with sheath blight susceptibility in rice［J］.Phytopathology，2007，97（10）：1207-1212.

［7］ 康霄文，龍曉波，彭紹裘，等.水稻紋枯病菌毒素的初步研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，23（1）：19-22.

［8］ Bateman D F.Alteration of cell wall components during pathogenesis byRhizoctonia solani［C］∥Mirocha C J，Uritani I.The dynamic role of molecular constituent in plant-parasite interactions St Paul Bruce Publishing Co，1967：58-59.

［9］ Sriram S，Raguchander T，Vidhyasekaran P，et al.Genetic relatedness with special reference to virulence among the isolates ofRhizoctonia solanicausing sheath blight in rice［J］.Zeitschrift fur Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz，1997，104（3）：260-271.

Effects of toxins on pathogenesis ofRhizoctonia solani

Liu Hongtao1，2， Cai Chao1， Liang Hongyan1， Lan Shaoming1， Zhang Juncheng1
（1.College of Agronomy，Guangxi University，Nanning530004，China；2.Laiwu Tobacco Company of Shandong，Laiwu271100，China）

The capability of toxin productionin vitroof 10strains ofRhizoctonia solaniwas determined using the method of seed germination inhibition.The results showed that the capability was different among different strains and the differences among strains reached significant level（p＜0.01）.The pathogenicity of the 10strains was determined using the method of detached-leaf inoculation.The results showed that the pathogenicity was also different among different strains，and the differences reached significant level（p＜0.01）.The capability of toxin production of the strainsin vitrowas highly positively correlated with the pathogenicity of the strains，according to correlation analysis.These results suggest that the toxin secreted byR.solanimight play an important role in pathogenesis of this pathogen on rice.

Rhizoctonia solani； toxin； pathogenesis

S 435.111.42

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.06.036

2010-11-08

2010-12-07

廣西教育廳科研基金（200709MS023）

＊ 通信作者 E-mail：jczhang＠gxu.edu.cn