韓為華 喬黎焱 劉鏝利 張麗萍 張志紅 馬 靜△

1第四軍醫(yī)大學（陜西西安 710032）

2第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院（陜西西安 710032）

二仙湯加味對去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα 的影響

韓為華1喬黎焱1劉鏝利1張麗萍1張志紅2馬 靜1△

1第四軍醫(yī)大學（陜西西安 710032）

2第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院（陜西西安 710032）

目的 探尋二仙湯加味對去卵巢大鼠心肌保護作用的機制。方法采用5月齡雌性大鼠建立去卵巢模型，隨機分為空白對照組、模型組、加味二仙湯高、中、低劑量組、替勃龍組，每組8只。二仙湯組分別用二仙湯30、15、7.5g/kg生藥劑量給藥，替勃龍組用0.25mg/kg給藥，其余兩組給予3mL生理鹽水灌胃，各組持續(xù)灌胃60d。采用免疫組化法分析心肌NF-κBp50、IκBα的表達。結(jié)果模型組與各治療組、空白組比較，NF-κBp50、IκBα的表達均顯著增高。二仙湯各劑量組與模型組比較，NF-κBp50、IκBα表達明顯降低。二仙湯組對心肌NF-κBp50、IκBα改善優(yōu)于替勃龍組。結(jié)論去卵巢大鼠心肌中存在NF-κBp50、IκBα的激活，加味二仙湯對其有一定抑制作用，可能是二仙湯心肌保護作用機制之一。

加味二仙湯 去卵巢 心肌細胞 NF-κBp50 IκBα

△通信作者

研究證實，女性絕經(jīng)前保持在一定水平的雌激素對心血管系統(tǒng)有一定的保護作用。隨著絕經(jīng)后卵巢功能的衰退，體內(nèi)雌激素水平下降，血脂代謝異常，血黏稠度增加，從而導致動脈硬化、冠心病的發(fā)病率顯著增加，因此，絕經(jīng)后冠心病機制的研究得到了廣泛重視。隨著研究的深入，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50及其抑制蛋白IκBα在絕經(jīng)后冠心病發(fā)病機制中的作用備受關(guān)注。本研究采用細胞免疫組化法評價加味二仙湯對去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα表達的影響，探討該方對心肌的保護機制.

1 實驗材料

1.1 動物 5月齡雌性SD大鼠48只，清潔級，體質(zhì)量（300±10）g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物 二仙湯加味組成：仙茅9g，淫羊藿9g，知母6g，黃柏6g，巴戟天 9g，當歸 9g，香附 6g，葛根 15g，遠志 6g。 中藥由西京醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)煎煮，濃縮為所需濃度中藥混懸液，含生藥3.0g/mL。替勃龍片 （南京歐加農(nóng)制藥有限公司），稀釋為0.025mg/mL混懸液。以上藥液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及儀器 NF-κBp50單克隆抗體及試劑盒：美國SantaCruz公司，武漢博士德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；超薄切片機：德國Rechert-Jung公司；TDR-9070A恒溫干燥箱：陜西天美科學儀器有限公司；Motic Med 6.0 CMIAS系列數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，麥克奧迪公司（中國廈門）生產(chǎn)；DAB顯色試劑；倒置顯微鏡。

1.4 分組與造模 將48只大鼠隨機分為6組：空白對照組、模型組、二仙湯高、中、低劑量組，替勃龍組，每組8只。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后，摘除卵巢，術(shù)后第5日開始，連續(xù)5d陰道涂片，每日1次，證明去勢徹底。

1.5 藥物干預 造模成功10d進行藥物干預，二仙湯高、中、低劑量組分別用二仙湯30、15、7.5g/kg劑量給藥，替勃龍組用0.25mg/kg給藥，其余組給予生理鹽水3mL灌胃，各組持續(xù)灌胃60d。

1.6 標本采集與檢測 灌胃結(jié)束第2日，將大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速剪開胸腔取心尖部組織，置于4%多聚甲醛溶液固定12h。 ①石蠟切片脫蠟、水化。②3%過氧化氫孵育5min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。③將切片放入盛有EDTA抗原修復液中，置微波爐中加熱至95℃以上并持續(xù)10min，室溫下自然冷卻，修復抗原。④滴加工作濃度1∶100的特異性抗體NF-κBp50/IκBα覆蓋組織切片，置于濕盒內(nèi)4℃過夜。PBS沖洗2min×3。⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃，20min，PBS沖洗，2min×3。⑥應用DAB溶液顯色。⑦蒸餾水沖洗、蘇木素復染、脫水、封片。采用CM IAS系列多功能真彩色病理圖分析系統(tǒng)對免疫組織學圖像進行分析，陽性細胞肌漿呈棕黃色表達。放大200倍，每張標本隨機輸入5個視野，取平均值，結(jié)果以面密度表示。

2 結(jié) 果

模型組心肌NF-κBp50、IκBα陽性表達均明顯高于其他組（P＜0.05），說明去卵巢能激活 NF-κBp50、IκBα 反應鏈，增加細胞因子 NF-κBp50、IκBα 的分解，并且激活 NF-κBp50 進入細胞核啟動相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄。同模型組比較，二仙湯各劑量組NF-κBp50表達均明顯減弱 （P＜0.05），其中高劑量組降低最為明顯，說明加味二仙湯各劑量均可抑制止NF-κBp50分解以及NF-kBp50激活，且療效優(yōu)于替勃龍組（P＜0.05）。

表1 各組去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表達比較 （±s）

表1 各組去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表達比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與替勃龍組比較，△P＜0.05。

組 別 n NF-κBp50（×10-2）空白對照組 8 5.41±1.62*模型組 7 16.54±2.48替勃龍組 7 13.21±1.74*IκBα（×10-2）4.38±0.52*16.21±1.55 14.26±0.53*二仙湯高劑量組 8 9.43±0.61*△ 10.34±0.17*二仙湯中劑量組 6 10.43±2.28* 12.17±0.85*二仙湯低劑量組 8 12.03±0.47*13.46±0.61*

3 討 論

中醫(yī)認為，女性絕經(jīng)后冠心病的發(fā)病機理是由于陽氣不足，鼓動無力，血行不暢、瘀阻心脈所致，屬于本虛標實之證。而且女性絕經(jīng)后卵巢功能減退，雌激素水平下降的生理特性與女子七七，腎氣虛衰、陰陽失調(diào)的病變基礎存在一定關(guān)系。因此，治療應側(cè)重從腎論治，以補腎通脈為綱，以益氣活血為基本治法，調(diào)整陰陽、調(diào)和沖任氣血[1]。加味二仙湯正是針對這一病機設立的有效方劑，是運用補益腎精、益氣活血之大法治療絕經(jīng)后冠心病臨床療效顯著。

絕經(jīng)后，隨著雌激素水平的不斷下降，機體脂質(zhì)代謝異常，血黏稠度增加，導致動脈粥樣硬化、冠心病的發(fā)病率明顯上升。大量證據(jù)證實冠心病與機體的炎癥過程存在一定相關(guān)性[2-3]。炎性反應的分子基礎與NF-κBp50因子的異常表達相關(guān)。NF-κBp50是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，當NFκB被激活并進入細胞核，與多種細胞基因啟動子或增強子序列位點發(fā)生特異性結(jié)合而引起一系列因子表達的增加，如內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、白介素-1B（IL-1B ）、白介素-6（IL-6）等[4]。通過炎癥介質(zhì)瀑布樣級鏈效應，引起心肌缺血再灌注損傷明顯增加以及冠脈血管內(nèi)皮細胞功能嚴重損害，可見在心肌損傷炎癥發(fā)生發(fā)展中NF-κBp50的介導扮演著重要的角色[5]。

總之，NFκBp50（IκBα）-IL-1B 重要的基因調(diào)控環(huán)節(jié)在絕經(jīng)后冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[6]。其不僅增強了局部炎癥反應，而且發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因的作用，即細胞的許多信號傳導途徑必須涉及到NFKB改變才體現(xiàn)出相應的效應。因此，在這一通路中任何一個環(huán)節(jié)細胞因子表達的增加，都會在絕經(jīng)后冠心病的發(fā)病中發(fā)生級聯(lián)反應，導致病變的加重；而阻斷這一途徑的任何一個環(huán)節(jié)，可以切斷這一通路上游刺激物與下游靶基因的病理性聯(lián)系，起到預防病變的發(fā)生或中止病變的發(fā)展的作用。

本研究證實，加味二仙湯能降低NF-κBp50核因子及其抑制蛋白 IκBα的表達，我們認為該藥正是通過阻斷 NFκBp50（IκBα）-IL-1B這一通路，中斷了上游刺激物與下游靶基因病理性的聯(lián)系，進而干預了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，阻止了對心血管的嚴重損害來發(fā)揮其心肌保護的治療作用。所以說，抑制NFκBp50（IκBα）因子的表達，可能是加味二仙湯心肌保護作用的重要機制之一。

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