李富強(qiáng)， 白宏英， 婁季宇， 曾志磊

缺血性腦卒中是一種高致殘高死亡的腦血管疾病，及時(shí)應(yīng)用藥物溶栓或血管內(nèi)支架疏通阻塞血管是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，伴隨血管再通產(chǎn)生的大量自由基或活性氧可以加重腦缺血損傷，即再灌注損傷。缺血再灌注損傷有效預(yù)防方法不多。盡管大量研究證實(shí)腦缺血預(yù)處理可以有效減輕缺血再灌注損傷［1］，但由于該干預(yù)措施必須在腦缺血發(fā)生前實(shí)施，而缺血性腦卒中發(fā)生的不可預(yù)料性限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。2006年Zhao等研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注早期給于短暫的缺血/再灌注循環(huán)可以顯著減少腦梗死面積，并提出了腦缺血后處理這一概念［2］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)被認(rèn)為是引起細(xì)胞凋亡或壞死的關(guān)鍵因素［3］。腦缺血后處理的作用機(jī)制未明，可能與減少組織自由基損傷、減輕炎性因子釋放、減輕腦水腫等［4］有關(guān)。腦缺血后處理能否影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換，尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察缺血腦組織MPT在腦缺血后處理過(guò)程中的變化，進(jìn)而探討腦缺血后處理的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作 采用Longa大鼠MCAO模型方法，略作修改。應(yīng)用10%水合氯醛(3ml/Kg)腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸外、頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端;在頸外動(dòng)脈殘端剪一小孔，將4-0號(hào)尼龍線前端加熱形成圓球形后從殘端小孔插入，沿頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦前動(dòng)脈以阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。阻閉30min后抽出尼龍線，恢復(fù)再灌注。應(yīng)用激光多普勒血流儀的探頭(P407，瑞典Perimed)檢測(cè)腦血流。切開(kāi)左側(cè)顱頂皮膚，并清理顱骨表面筋膜，將探頭放置在左側(cè)囟門后中線外2mm處。左側(cè)大腦中動(dòng)脈腦血流下降低于70%視為造模不成功予以排除。術(shù)中體溫由肛溫探頭監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)，用150瓦燈泡烘烤維持肛溫37℃。

1.2 動(dòng)物分組 清潔級(jí)SD雄性大鼠(250g～300g)由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠隨機(jī)分成4組:(1)假手術(shù)組(sham);(2)缺血再灌注組(I/R);(3)缺血后處理組(Postcond);(4)延遲缺血后處理組(Delaypost)(每組n=20)。假手術(shù)組采用同樣的操作步驟，僅暴露頸總動(dòng)脈但不插入頸內(nèi)動(dòng)脈;缺血再灌注組:缺血30min后給予再灌注;缺血后處理組:缺血30min再灌注時(shí)，立即給予30s再灌注/30s缺血處理，反復(fù)3個(gè)循環(huán);延遲缺血后處理組:缺血30min再灌注15min后，再給予30s再灌注/30s缺血，反復(fù)3個(gè)循環(huán)(見(jiàn)圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組示意圖

1.3 腦組織勻漿的制備 各組大鼠(n=6)于再灌注30min后斷頭處死，用冷生理鹽水沖洗血跡后，濾紙拭干，稱重，按組織比生理鹽水1∶9加人冰冷的生理鹽水，制成10%勻漿。所有操作均在4℃下進(jìn)行。

1.4 腦線粒體的制備 各組大鼠(n=6)于再灌注30min后斷頭處死，立即取出大腦，去除腦干、嗅球及小腦，留取左側(cè)大腦半球。冷生理鹽水沖洗血跡后，將腦組織置于預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4，0.01 mol/L EGTA)的緩沖液中。用預(yù)冷的眼科剪將腦組織剪成2mm×2mm×2mm的小塊后充分勻漿，制成10%的勻漿。采用差速離心法分離線粒體，應(yīng)用低溫高速離心機(jī)4℃以650×g離心20min后棄沉淀;取上清液以 7700×g離心 20min，將沉淀應(yīng)用(0.25mol/L Sucrose，0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4)溶液懸浮即制成線粒體懸浮液;上述操作均在4℃下進(jìn)行［5］。采用Bradford法進(jìn)行線粒體蛋白濃度測(cè)定。

1.5 腦梗死面積測(cè)定 大鼠腦缺血30min再灌注24h后，斷頭，迅速取腦，每組各8只。鼠腦沿冠狀切面切片，每片厚約2mm，腦片迅速置于2%的TTC溶液中37℃蘊(yùn)育約30min，正常組織呈玫瑰紅色，缺血梗死組織則為蒼白色，10%福爾馬林溶液固定后，用數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算梗死面積百分比。梗死容積=(對(duì)側(cè)正常組織容積－同側(cè)正常組織的容積)/對(duì)側(cè)正常組織容積×100%。

1.6 腦組織丙二醛測(cè)定 硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)組織丙二醛，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產(chǎn)物，在532nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。具體方法按南京建成科技有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放測(cè)定 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放引起線粒體腫脹，導(dǎo)致線粒體吸光度下降［6］。應(yīng)用線粒體腫脹測(cè)定液(0.2 mol/L sucrose，10mmol/L Tris-Mops，pH7.4，5mmol/L succinate-Tris，1mmol/L Pi-Tris，10μmol/L EGTA-Tris，2μmol/L rotenone，1μg/ml oligomycin)將線粒體稀釋濃度為 0.5mg/ml蛋白溶液。反應(yīng)條件控制在25℃、pH7.4。反應(yīng)開(kāi)始在反應(yīng)體系內(nèi)加入150μmol/LCa2+作為激發(fā)劑，應(yīng)用 UV-2000紫外分光儀(尤尼柯，上海)在540nm處檢測(cè)線粒體吸光度的改變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用±s來(lái)表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理對(duì)腦梗死容積影響 缺血再灌注24h后，缺血后處理組與缺血再灌注組和延遲缺血后處理組相比腦梗死容積明顯減小(P＜0.05);延遲缺血后處理組與缺血再灌注組相比腦梗死容積變化無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 缺血后處理對(duì)腦梗死容積的影響

2.2 缺血后處理對(duì)腦組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響 與缺血再灌注組和延遲缺血后處理組相比，缺血后處理組和假手術(shù)組腦組織丙二醛含量顯著降低(P＜0.05);延遲缺血后處理組與缺血再灌注組相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 缺血后處理對(duì)腦組織MDA的影響

2.3 缺血后處理對(duì)通透性轉(zhuǎn)換孔的影響 缺血后處理明顯抑制Ca2+所誘發(fā)的540nm波長(zhǎng)處線粒體吸光度的改變(P＜0.05)，而延遲缺血后處理組與缺血再灌注組兩者差別無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(見(jiàn)圖4);延遲缺血后處理組和缺血再灌注組線粒體吸光度改變值明顯增加，但兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 缺血后處理對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響

3 討論

Zhao等首先應(yīng)用大鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端永久閉塞聯(lián)合雙側(cè)頸總動(dòng)脈短暫閉塞腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)再灌注時(shí)立即給予3個(gè)30s缺血/再灌注循環(huán)可以明顯減少腦梗死容積，減少半暗帶區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，減輕缺血區(qū)腦組織的氧化損傷等。其研究結(jié)果還表明，缺血后處理的保護(hù)作用與缺血嚴(yán)重度呈負(fù)相關(guān)，缺血越嚴(yán)重缺血后處理的保護(hù)作用越弱;再灌注損傷是缺血時(shí)期的重要病理過(guò)程，缺血后處理可以明顯減輕缺血再灌注損傷［2］。本研究結(jié)果提示:腦缺血后處理有明顯的腦保護(hù)作用;腦缺血后處理的腦保護(hù)作用有時(shí)間依賴性，再灌注時(shí)立即缺血后處理保護(hù)作用明顯，延遲15min的缺血后處理未顯示明確的腦保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型發(fā)現(xiàn):再灌注期即刻給予3個(gè)30s的缺血/再灌注循環(huán)的缺血后處理能明顯減小腦梗死容積，但延遲缺血后處理未能減少腦梗死容積。而且缺血后處理能明顯減少腦組織中膜磷脂過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量，而延遲缺血后處理未顯示類似的效應(yīng)。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換是反映線粒體功能及完整性的重要指標(biāo)。線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)非特異性開(kāi)放將導(dǎo)致膜電位的崩潰，線粒體內(nèi)呼吸鏈的解偶聯(lián)，細(xì)胞色素C及其他促凋亡因子的釋放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。我們研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后處理能抑制Ca2+誘導(dǎo)的mPTP開(kāi)放，而延遲15min的缺血后處理組與缺血再灌注組mPTP開(kāi)放增加，兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果表明延遲缺血后處理不能減少mPTP的開(kāi)放。缺血后處理調(diào)節(jié)mPTP開(kāi)放機(jī)制尚不清楚。實(shí)驗(yàn)研究表明，活性氧促發(fā)和 Ca2+超載是影響 mPTP開(kāi)放關(guān)鍵因素［8］。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)缺血期缺血腦組織血流量下降了約50%，但再灌注早期缺血腦組織有類似充血的反應(yīng)，腦血流增加到180.1% ±46.0%，而應(yīng)用缺血后處理可以減弱再灌注早期的類似充血的反應(yīng)［2］。在缺血期，由于無(wú)氧酵解增加，腦組織中乳酸含量明顯升高，線粒體ATP酶活性降低，ATP合成減少。由于ATP合成減少，不能有效泵出Na+、Ca2+，最終引起Na+、Ca2+超載，溶酶體泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜磷脂的損害［9］。應(yīng)用藥物溶栓或血管介入使阻塞血管再通，可以阻斷上述病理過(guò)程。但隨之出現(xiàn)缺血再灌注損傷。再灌注早期血液中的氧與缺血組織內(nèi)單電子物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生大量的活性氧，誘導(dǎo)mPTP開(kāi)放破壞線粒體膜，加速線粒體膜腫脹破壞，釋放細(xì)胞色素C及其他促凋亡因子，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死［7］。我們推測(cè)缺血后處理可能通過(guò)減少再灌注時(shí)期活性氧的生成，增加線粒體對(duì)Ca2+超載的抵抗能力而起作用。缺血后處理可能通過(guò)減弱再灌注早期的類似充血的反應(yīng)，減少活性氧的生成，減輕了線粒體膜的損傷，維持線粒體內(nèi)外離子平衡。我們研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理可以降低MDA的生成間接驗(yàn)證了缺血后處理減少活性氧物質(zhì)生成。延遲缺血后處理可能因不能有效減弱再灌注早期的類似充血的反應(yīng)，故不能減少活性氧的促發(fā)，而不能起到腦保護(hù)作用。Argaud等在New Zealand兔心肌缺血再灌注模型研究中發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后處理可以增加線粒體對(duì)Ca2+超載的抵抗能力、延遲Ca2+誘導(dǎo)的mPTP開(kāi)放而起到心肌保護(hù)作用［10］。此類保護(hù)機(jī)制是否存在于腦缺血再灌注損傷模型中，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

當(dāng)然我們的研究也有一定的局限性:首先我們僅僅觀察了24h內(nèi)的腦保護(hù)作用，是否有更長(zhǎng)久的腦保護(hù)作用尚未知。其次，我們選擇30s缺血/再灌注循環(huán)源自Zhao等的研究報(bào)告，是否是最佳干預(yù)時(shí)間尚未知，需進(jìn)一步研究證實(shí)。再次，我們選擇延遲15min實(shí)施延遲缺血后處理，是基于在一些研究模型中發(fā)現(xiàn)再灌注早期活性氧生成在4～7min達(dá)峰值。延遲多久不會(huì)對(duì)缺血后處理腦保護(hù)作用產(chǎn)生干擾，還需進(jìn)一步研究。

腦缺血后處理作為一種新奇的、簡(jiǎn)單的腦保護(hù)措施，給臨床治療提供了一種新的治療策略。腦缺血后處理可能應(yīng)用在藥物溶栓或血管內(nèi)介入血管再通的治療過(guò)程中。但其安全性、有效性需要大量基礎(chǔ)與臨床研究去證實(shí)?？傊覀冄芯堪l(fā)現(xiàn)腦缺血后處理可能通過(guò)抑制mPTP開(kāi)放起到腦保護(hù)作用，其保護(hù)作用有時(shí)間依賴性。腦缺血后處理可能會(huì)成為治療缺血性腦卒中新的方法之一。

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