邸子真，王光函，姜鴻，鄒桂欣

(遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室，沈陽(yáng)110034)

中華苦荬菜含有三萜類、倍半萜類、木犀草素及其苷、洋芹苷等黃酮類成分和多種維生素[1-2]。同屬植物抱莖苦荬菜[Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance]被制成注射液用于治療糖尿病并發(fā)癥，取得了良好的療效[3]。齒緣苦荬菜[Ixeris dentate(Thunb)Nakai]在韓國(guó)被作為抗糖尿病的民間草藥[4]，但筆者未見中華苦荬菜抗糖尿病的報(bào)道。糖化血紅蛋白(glycolated hemoglobin，HbAlC)和果糖胺分別表示近8～12周和近2～3周的血糖水平，彌補(bǔ)了血糖值時(shí)效性太強(qiáng)的缺點(diǎn)，對(duì)于了解平均血糖水平具有實(shí)際意義，其高低與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展呈明顯相關(guān)性[5]。

筆者在本研究中對(duì)高脂血癥糖尿病模型大鼠給予不同劑量中華苦荬菜提取物，發(fā)現(xiàn)中華苦荬菜在降低HbAlC和果糖胺方面有顯著的效果，并將藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各提取物指紋圖譜相對(duì)峰面積相關(guān)聯(lián)，通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件相關(guān)分析初步確定中華苦荬菜中與抗糖尿病作用相關(guān)物質(zhì)的色譜峰，為進(jìn)一步發(fā)掘中華苦荬菜的藥用價(jià)值奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料

中華苦荬菜藥材采自遼寧省沈陽(yáng)市，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)所王維寧教授鑒定為菊科植物中華苦荬菜全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備取干燥中華苦荬菜藥材揉碎，分別加10倍量和8倍量水各提取1次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮，放冷，取少量樣品供指紋圖譜分析用，其余用等倍量石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3次，合并各萃取溶液，減壓回收溶劑至稠膏，少量溶劑溶解，分別加入糊精適量，干燥，研勻，制成樣品每克相當(dāng)于藥材10 g的粉末:1號(hào)提取物(石油醚層)、2號(hào)提取物(乙酸乙酯層)、3號(hào)提取物(正丁醇層)。萃取剩余水溶液減壓干燥至干，稱定質(zhì)量，粉碎成每克相當(dāng)于藥材3.25 g的細(xì)粉，作為4號(hào)提取物。以上各提取物分別干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取物指紋圖譜分析

2.2.1 儀器與試藥Agilent 1100高效液相色譜分析儀:四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司)。乙腈(天地公司，色譜純，批號(hào):1004900)，冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)，色譜純，批號(hào):200907161217FC)，水(杭州娃哈哈純凈水，批號(hào):T20070911)，其他試劑均為分析純。

2.2.2 色譜條件色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A:0.8%醋酸水溶液，B:0.8%醋酸乙腈溶液，梯度洗脫;流速:1 mL·min-1;DAD檢測(cè)器，梯度檢測(cè)波長(zhǎng);柱溫:30℃;圖譜記錄105 min。

2.2.3 供試品溶液的制備取“2.1”項(xiàng)下1～4號(hào)提取物各1 g，精密稱定，加甲醇50 mL，回流提取2 h，過濾，蒸干，1號(hào)定容至1 mL，2，3號(hào)分別定容至2 mL，搖勻，取少量溶液高速離心，吸取上清液作為供試品溶液。取4號(hào)提取物細(xì)粉1 g，精密稱定，用純化水定容至15 mL，混勻，取少量高速離心，吸取上清液作為供試品溶液。

2.2.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜分析取各供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。取木犀草苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，并將保留時(shí)間與樣品各指紋峰比較。1～4號(hào)提取物共得到36個(gè)共有峰，其中X27與木犀草苷對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同。

2.3 提取物對(duì)高脂血癥糖尿病大鼠的作用Wistar大鼠[吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)，合格證號(hào):SCXK(吉)2003-0001]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱體質(zhì)量，隨機(jī)取10只喂以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料。其他大鼠喂高脂飼料(在標(biāo)準(zhǔn)飼料中加入10%豬油，10%蛋黃粉和20%蔗糖)，8周后，按30 mg·kg-1劑量一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4)。測(cè)48 h后的空腹血糖值和灌胃20%葡萄糖溶液(2 g·kg-1)后30，60，120 min的血糖值，即葡萄糖耐量。選擇空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或灌胃葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)服糖后2h血糖≥11.1 mmol·L-1的大鼠作為受試模型。將造模成功的糖尿病大鼠分為7組，分別為模型組、1～4號(hào)提取物組、陽(yáng)性對(duì)照組1(二甲雙胍)、陽(yáng)性對(duì)照組2(參芪降糖顆粒)，各給藥組大鼠按相應(yīng)劑量灌胃給予對(duì)應(yīng)藥液，給藥容積均為20 mL·kg-1，模型組和空白組灌胃給予等量純化水，連續(xù)給藥4周后，禁食12 h，腹主動(dòng)脈采血測(cè)定HbAlC和果糖胺，結(jié)果見表1。

表1 8組大鼠HbAlC與果糖胺測(cè)定結(jié)果Tab.1ResultsofHbAlCandfructosamine determination in 8 groups of rats ±s

表1 8組大鼠HbAlC與果糖胺測(cè)定結(jié)果Tab.1ResultsofHbAlCandfructosamine determination in 8 groups of rats ±s

與模型組比較，*1P＜0.05Compared with model group，*1P＜0.05

組別大鼠數(shù)HbAlC/%果糖胺/(mmol·L－1)1號(hào)提取物組1014.19±2.030.24±0.02 2號(hào)提取物組1013.71±1.57*10.23±0.01*1 3號(hào)提取物組1013.44±1.18*10.23±0.02*1 4號(hào)提取物組912.81±0.87*10.24±0.02陽(yáng)性對(duì)照組11010.77±1.60*10.23±0.03陽(yáng)性對(duì)照組2912.40±1.36*10.25±0.02模型組1015.04±0.990.25±0.02空白組125.58±0.22*10.17±0.01*1

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與結(jié)果使用SPSS13.0版軟件中的雙變量相關(guān)分析可以得到變量?jī)蓛芍g的皮爾遜系數(shù)及其統(tǒng)計(jì)量。根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果可知，與降低HbAlC呈正相關(guān)的色譜峰有X26(tR=50.47 min)，X28(tR=53.75 min)，X34(tR=60.58 min)，與降低果糖胺呈正相關(guān)的色譜峰有X29(tR=55.14 min)，X30(tR=57.48 min)，X32(tR=58.85min)，X33(tR=59.78 min)。提示以上色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能具有降低HbAlC和果糖胺的作用。

3 討論

HbAlC是衡量血糖的金指標(biāo)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)于2010年開展了中國(guó)HbAlC教育計(jì)劃，以便使更多的臨床醫(yī)生及患者認(rèn)識(shí)到HbAlC的檢測(cè)和臨床應(yīng)用的重要性。近年研究表明，控制HbAlC水平可使由糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及清蛋白尿等的風(fēng)險(xiǎn)大幅下降;使并發(fā)高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低[5-7]。果糖胺的濃度與血糖水平呈正相關(guān)，并且相對(duì)穩(wěn)定，日間變異小，由于血漿蛋白的半衰期為17～20 d，故可反映檢測(cè)前2～3周內(nèi)的平均血糖水平，從一定程度上彌補(bǔ)了HbAlC不能反映較短時(shí)期中血糖濃度變化的不足[8-9]。應(yīng)用果糖胺與HbAlC聯(lián)合測(cè)定，有利于更準(zhǔn)確地掌握一段時(shí)間之內(nèi)血糖的變化情況，為評(píng)價(jià)藥品穩(wěn)定血糖的能力提供更科學(xué)的依據(jù)。

在樣品指紋圖譜測(cè)定中，筆者采用醋酸水-乙腈系統(tǒng)，隨著乙腈比例的增加基線逐漸升高，后在乙腈中也加入了同樣比例的醋酸，使酸度保持恒定，解決了基線漂移的問題。Agilent 1100配置的DAD檢測(cè)器可以同時(shí)進(jìn)行5個(gè)波長(zhǎng)的掃描，通過多個(gè)波長(zhǎng)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)0～20 min在252 nm波長(zhǎng)下色譜峰的信息量大且各色譜峰有較高的響應(yīng)值，20 min之后324 nm下各主要色譜峰的響應(yīng)值大，基線干擾小，所以設(shè)置了梯度檢測(cè)波長(zhǎng)。

在該色譜條件下，對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行了在線紫外掃描，獲得了每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)的紫外掃描圖譜(波長(zhǎng)190～400 nm)。發(fā)現(xiàn)X26，X28，X29，X30，X32，X33，X34色譜峰均在230～232 nm和316～329 nm兩處有較強(qiáng)的吸收峰。提示他們有可能為具有相同或相似官能團(tuán)的物質(zhì)。將3號(hào)提取物回流提取之后調(diào)成酸性，用乙酸乙酯萃取，再通過D101大孔吸附樹脂柱分離，可于40%乙醇洗脫液中得到較純的該物質(zhì)群，提示其為中等極性，與木犀草苷極性相似的物質(zhì)。

同屬植物抱莖苦荬菜的注射液已經(jīng)在治療糖尿病并發(fā)癥發(fā)面取得了良好的療效，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示中華苦荬菜也有可能成為一種防止或延緩糖尿病并發(fā)癥的良藥，而且抱莖苦荬菜中治療糖尿病并發(fā)癥的有效成分可能就是中華苦荬菜降低HbAlC和果糖胺的同類成分，還有待對(duì)兩種中藥的對(duì)比研究進(jìn)一步證實(shí)。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(第二十一卷)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:879－880.

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