朱潔瑾，廖守法，趙樂萍，都霞，林蒙蒙，潘建春

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035；2.溫州光明醫(yī)院，浙江 溫州 325001；3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬樂清醫(yī)院 藥劑科， 浙江 溫州 325600）

任何來自環(huán)境、社會、工作、生活、軀體精神、心理的刺激均能使機(jī)體處于生理或心理的應(yīng)激之中?，F(xiàn)代文明社會的發(fā)展和高科技對人類生存環(huán)境全方位的滲透，使人類承受著越來越復(fù)雜、越來越強(qiáng)烈的生理和心理應(yīng)激。適當(dāng)應(yīng)激可增強(qiáng)人們對外界有害因素的免疫和抗御能力，但持久的應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂，使機(jī)體出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙、抑郁癥、應(yīng)激性精神紊亂、癡呆等多系統(tǒng)的損壞[1-2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與認(rèn)知行為功能密切相關(guān)的腦區(qū)，富含各種信使受體，尤其是富含糖皮質(zhì)激素受體，在應(yīng)激反應(yīng)中，它不僅是高位調(diào)節(jié)中樞，更是受應(yīng)激累及的最敏感區(qū)域，極易受到高濃度糖皮質(zhì)激素的攻擊[3]。慢性應(yīng)激或長期在應(yīng)激水平糖皮質(zhì)激素的作用下，會使海馬神經(jīng)元發(fā)生萎縮甚至死亡[4]。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）通路的激活介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)并促進(jìn)神經(jīng)元再生。

姜黃素（curcumin)是從姜科植物Curcuma longa L.中提取的一種相對分子質(zhì)量小的多酚類物質(zhì)，通常認(rèn)為它是姜黃中的最有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用[5]。因此本研究采用綜合性交替刺激，建立大鼠慢性應(yīng)激模型，并觀察其空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化模式，同時(shí)從神經(jīng)保護(hù)的角度探討姜黃素對慢性應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠腦內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 姜黃素、氟西汀購自美國Sigma公司。姜黃素用花生油溶解，氟西汀用雙蒸水溶解，不同劑量的姜黃素（2.5、5.0和10 mg/kg）和氟西?。?0 mg/kg）分別口服和腹腔注射21d，末次給藥后60min（姜黃素）和30min（氟西汀）開始實(shí)驗(yàn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，花生油和雙蒸水用作對照組，兩種溶液對大鼠行為學(xué)結(jié)果的影響沒有明顯差異。因此，正式實(shí)驗(yàn)選擇花生油作為對照組。兔抗人BDNF多抗、兔抗大鼠CREB、pCREB多抗、ECL發(fā)光底物顯色試劑盒均購自美國SantaCruz公司。

1.2 主要儀器 精密電子天平（FA-1004），上海精科天平廠生產(chǎn)；八臂迷宮；MG-3Y迷宮刺激器（張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠）；EPS601型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國Amersham公司)；DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C型石墨電極水平電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，購自溫州醫(yī)學(xué)院動物中心。飼養(yǎng)條件：4只/籠，室溫（22±1）℃，濕度50%±10%，自然光照，自由攝食飲水。所有動物于飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)7d后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12～16h，食水自由。隨機(jī)分為6組（每組8只）：正常對照組、應(yīng)激模型組、姜黃素組（2.5、5和10 mg/kg）、氟西汀組（10 mg/kg）。

1.4 大鼠慢性應(yīng)激模型的建立 慢性應(yīng)激時(shí)程共計(jì)21d，每日1次，時(shí)間：上午9:00-下午2:00之間，應(yīng)激組每天選取7種刺激中的一種進(jìn)行刺激：強(qiáng)迫游泳（水溫10 ℃）5 min；制動2 h；夾尾（距尾根1 cm）1 min；禁水（水瓶取掉12 h后，放空瓶1 h，之后恢復(fù)正常飲水）；禁食（鼠糧取空12 h后，每籠放3 g鼠糧2 h，之后恢復(fù)正常飲食）；足底電擊（1 mA，時(shí)程1 s，1次/min）30 min；換籠孤養(yǎng)24 h；刺激時(shí)間和形式每天隨機(jī)。每日測定體重，于每天實(shí)驗(yàn)前60 min或30 min按體重給予不同劑量的姜黃素（2.5、5、10 mg/kg，p.o.）、花生油或氟西?。?0 mg/kg，i.p.）。第21天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Y迷宮實(shí)驗(yàn) Y型電迷路三臂（I、II、III）間的夾角為120°，每一臂尺寸30 cm×8 cm×15 cm（長×寬×高），各臂末端均裝有信號燈。將大鼠放入迷宮刺激器的一臂，適應(yīng)環(huán)境5 min后給予電刺激（60 V，持續(xù)2 s)。其余兩臂中的任一臂給予燈光信號，示為安全區(qū)。大鼠進(jìn)入安全區(qū)，為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。第2次訓(xùn)練以此安全區(qū)作為起步區(qū)，并使大鼠停留在安全區(qū)1 min以鞏固記憶。再給予電刺激，以此類推，按方向（I-II-III-I）依次改變安全區(qū)位置。開始訓(xùn)練時(shí)，小鼠受電擊逃離起步區(qū)后直接跑向安全區(qū)，或跑向非安全區(qū)，并在電擊作用下最終才跑至安全區(qū)（被動回避反應(yīng)），故會出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)。多次訓(xùn)練后，安全區(qū)燈亮，電刺激尚未開始時(shí)，小鼠立即逃往安全區(qū)，即為形成明暗辨別條件反射（主動回避反應(yīng)）。測試成績分為學(xué)習(xí)成績和記憶成績，測試達(dá)到連續(xù)10次中有9次（9/10）正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)即嘗試次數(shù)表示學(xué)習(xí)能力[6]；記憶成績以學(xué)習(xí)完后再電擊10次中正確反應(yīng)的次數(shù)（n/10）為準(zhǔn)，于應(yīng)激前后記錄測試成績。

1.6 八臂迷宮實(shí)驗(yàn) 八臂迷宮中動物通過觀察周圍一些固定的參照物來學(xué)習(xí)和記憶自身與餌（置于迷宮臂末端的一顆鼠糧）的相對位置。訓(xùn)練前大鼠先在迷宮中適應(yīng)2 d，每天1次。每次訓(xùn)練中，八臂中只有四臂放置了餌（分別是1、2、4和7號臂），整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央?yún)^(qū)，此時(shí)中央?yún)^(qū)四周用門關(guān)住，15 s后門開放，大鼠可選擇進(jìn)入任意一臂，以攝取餌。大鼠進(jìn)人有餌的臂且攝取了餌為一次正確選擇，進(jìn)入餌臂而未攝取餌或重新進(jìn)入放餌臂稱為工作記憶錯(cuò)誤（working memory error，WME），進(jìn)入不放餌臂稱為參考記憶錯(cuò)誤（reference memory error，RME），總記憶錯(cuò)誤（TE）記為WME和RME的總和。共訓(xùn)練約l0～l5次，連續(xù)5次訓(xùn)練TE不超過1，且WME為0，認(rèn)為訓(xùn)練成功。

1.7 組織蛋白提取與定量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，冰上斷頭取腦，迅速剝離全腦，分離完整的海馬，按照50 mg組織/500μL裂解液的比例冰浴勻漿組織，裂解30 min后超聲處理溶液10 s，裂解液于4 ℃、13000 r/min離心20 min。吸取上清，測定蛋白含量。蛋白定量測定應(yīng)用考馬斯亮蘭標(biāo)準(zhǔn)定量方法。595 nm下測光密度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度對光密度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品蛋白濃度

1.8 檢測指標(biāo) Western blot檢測pCREB、BDNF，操作均嚴(yán)格按說明書和實(shí)驗(yàn)室要求進(jìn)行。膠片掃描并用Scionimage 4.02 Beta軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 蛋白免疫印跡分析和行為學(xué)成績均用±s表示，采用單因素方差分析法，組間差異采用Dunnett’s檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1）顯示，與正常對照組相比，應(yīng)激模型組大鼠學(xué)習(xí)所需的嘗試次數(shù)顯著增加（P<0.01），而姜黃素組大鼠學(xué)習(xí)完成所需訓(xùn)練次數(shù)均明顯少于應(yīng)激模型組（P<0.05，P<0.01)；停止訓(xùn)練后姜黃素大鼠記憶成績明顯高于應(yīng)激模型組（P<0.05)。

表1 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的成績比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的成績比較（±s，n=8）

與正常對照組比：##P<0.01；與應(yīng)激模型組比：*P<0.05，**P<0.01

組別 劑量（mg/kg） 學(xué)習(xí)成績 記憶成績正常對照應(yīng)激模型姜黃素氟西汀2.5 5 10 10 29.33±4.32 48.00±4.34##44.00±3.89 40.17±4.79*39.00±1.26**37.67±7.03**8.33±1.03 4.67±1.21##6.00±0.89 6.33±1.03*6.50±1.05*7.00±0.63**

2.2 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的影響表2顯示，與正常組相比，應(yīng)激模型組的TE明顯增多（P<0.001)；2.5 mg/kg姜黃素組的TE減少不明顯（P>0.05)；10 mg/kg姜黃素組和氟西汀組的TE較模型組明顯降低（P<0.01)。

表2 各組大鼠八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的成績比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的成績比較（±s，n=8）

與正常對照組比：##P<0.01；與應(yīng)激模型組比：*P<0.05，**P<0.01

組別正常對照應(yīng)激模型姜黃素氟西汀2.5 5 10 10 2.83±0.75 7.33±2.58##4.83±1.47 4.50±1.38*4.33±0.82**3.67±0.52**劑量（mg/kg）TE

2.3 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響圖1顯示，蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激大鼠海馬中BDNF的表達(dá)均明顯下降（P<0.01)，姜黃素和氟西汀慢性給藥拮抗了慢性應(yīng)激引起的BDNF表達(dá)的下調(diào)（P<0.01)。

圖1 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠BDNF在海馬中表達(dá)的影響（n=6±s）

2.4 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠海馬磷酸化的CREB（pCREB）水平的影響 圖2顯示，pCREB變化明顯，慢性應(yīng)激大鼠額海馬中pCREB的表達(dá)水平與正常對照組相比明顯下降（P<0.01），而給予10 mg/kg姜黃素后，海馬中pCREB的表達(dá)水平與應(yīng)激組比較上升（P<0.01），給予氟西汀組的pCREB表達(dá)水平也顯著上調(diào)（P<0.01）。

圖2 姜黃素對慢性應(yīng)激大鼠pCREB在海馬中表達(dá)的影響（n=6±s）

3 討論

隨著社會的發(fā)展及各方面競爭壓力的增加，人們易產(chǎn)生緊張、抑郁、焦慮等情緒反應(yīng)。許多資料顯示長期應(yīng)激可損害健康，引發(fā)疾病；同時(shí)影響腦的認(rèn)知能，包括學(xué)習(xí)記憶等。目前，應(yīng)激對腦功能，尤其對學(xué)習(xí)記憶能力的影響引起了人們極大的關(guān)注，并已成為神經(jīng)科學(xué)和心理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[7]。目前認(rèn)為，慢性應(yīng)激減少腦內(nèi)一些關(guān)鍵神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子對于神經(jīng)元的發(fā)育、分化和存活，以及成熟神經(jīng)元發(fā)揮功能是必需的。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種，有研究報(bào)道，它是維持神經(jīng)元功能和再生修復(fù)及防止神經(jīng)元退行性病變的重要細(xì)胞因子[8]。另外其對神經(jīng)元的可塑性也具有一定的影響[9]。以前的研究證明，慢性應(yīng)激與BDNF表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)，幼年期母愛剝奪的大鼠，在成年后其海馬BDNF的水平降低[10]。慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為持續(xù)的功能性的BDNF調(diào)節(jié)缺陷，可能是因?yàn)閼?yīng)激狀態(tài)下，有效的反應(yīng)能力遭到損害[11]，大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變和大量丟失、腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量改變，致其發(fā)生抑郁，同時(shí)其介導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)記憶功能顯著下降[12]。本研究通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可引起海馬中BDNF的表達(dá)減少，而姜黃素慢性給藥明顯拮抗這種效應(yīng)。這說明姜黃素能增強(qiáng)抑郁動物的學(xué)習(xí)記憶能力，其涉及的機(jī)制與BDNF的上調(diào)有關(guān)，影響海馬及前腦皮層神經(jīng)細(xì)胞再生及突出可塑性，保護(hù)慢性應(yīng)激引起的海馬和前腦皮層神經(jīng)元的損傷[13]。這一作用與經(jīng)典藥物氟西?。?0 mg/kg，i.p.）相似，提高海馬BDNF水平，促神經(jīng)元再生[14]。應(yīng)激誘導(dǎo)BDNF下調(diào)的確切機(jī)制還不清楚，糖皮質(zhì)激素受體激活后抑制BDNF基因啟動子的轉(zhuǎn)錄可能起到一定作用，但一些細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能也參與了這一過程。

相關(guān)研究表明，cAMP-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與應(yīng)激誘導(dǎo)的BDNF下調(diào)有關(guān)，這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑郁發(fā)病中受損[15]。CREB具有轉(zhuǎn)錄激活作用的關(guān)鍵在于其Ser133位點(diǎn)的磷酸化，磷酸化后CREB才能與cAMP反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合，從而誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激對海馬中總的CREB影響不明顯，但pCREB在應(yīng)激狀態(tài)下明顯減少，說明應(yīng)激確實(shí)影響了CREB的磷酸化；姜黃素可以拮抗應(yīng)激狀態(tài)下pCREB的減少。這結(jié)果提示慢性應(yīng)激很可能使腦中cAMP-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，阻斷了CREB的磷酸化，使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá)減少，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙癥狀的出現(xiàn)；姜黃素可以逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激對大鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷可能與上調(diào)cAMP-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響神經(jīng)元存活及其可塑性機(jī)制有關(guān)。

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