周輝，盛漢松，張弩，林堅(jiān)，尹波

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325027）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和紋狀體區(qū)多巴胺（DA）水平減少為主要病理生理特點(diǎn)[1]。多能成體祖細(xì)胞（MAPCs）的許多特性也使其逐漸成為了細(xì)胞移植治療中理想的細(xì)胞資源之一。有研究表明，骨髓間質(zhì)MAPCs在體外培養(yǎng)環(huán)境中能夠增殖并可以分化為各種譜系的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞等[2-4]。本實(shí)驗(yàn)將體外純化、標(biāo)記處理的骨髓間質(zhì)MAPCs移植到PD大鼠腦內(nèi)，觀察MAPCs的腦內(nèi)存活和神經(jīng)分化情況，對(duì)移植大鼠采用免疫組化技術(shù)、免疫電鏡等方法鑒定和分析MAPCs在大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)，分析MAPCs神經(jīng)元樣細(xì)胞分化和修復(fù)神經(jīng)功能的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：成年SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量80～100 g 4只（用于提取骨髓）和體質(zhì)量180～200 g 70只（用于建立PD大鼠模型），由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)行為學(xué)測(cè)試確認(rèn)無震顫、嗅探及旋轉(zhuǎn)等異常行為后，將動(dòng)物置于鼠箱內(nèi)，給予充足的水和飼料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：低糖的Dulbecco改良eagle培養(yǎng)基（L-DMEM，GIBCOBRL公司），胎牛血清（FCS，Hyclone公司），100 ng/mL LIF，F(xiàn)icoll-paque液（Ficoll-paque density gradient centrifugation，Sigma公司）；Buffer液（Miltenyi Biotec公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、成纖維細(xì)胞生長因子-8（FGF-8）、Triton X-100 液、鼠單克隆抗體（NSE和MAP-2）、羅達(dá)明標(biāo)記的羊抗鼠抗體（Rhodamine-labeled affinity purified antibody to mouse IgG）、熒光素標(biāo)記的羊抗鼠抗體（fluorescein-labeled affinity purified antibody to mouse IgG）購自Sigma公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（GIBCOBRL公司）；氯化氨、碳酸氫鈉、肝素、PBS、多聚甲醛、二甲苯、乙醇等。

1.1.3 主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購于晶美生物工程有限公司；微量加樣器（上海高欣玻璃儀器廠）；Olympus倒置顯微鏡（日本）；Nikon熒光顯微攝像系統(tǒng)（日本）；透射電鏡（EM-10C型，德國Opton公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱；低溫超速離心機(jī)（XL-100型，美國Deckman公司）；CD45-Gly-A-cell isolation kit、MACS高強(qiáng)磁場、MACS陰性選擇柱（Miltenyi Biotec公司）；腦立體定位儀（西北光學(xué)儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 建立PD大鼠模型：健康SD大鼠用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉。參照Paxinos and Watson《The Rat Brain》圖譜，選擇黑質(zhì)致密部（SNpc，坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，中逢左旁開2.0 mm，硬膜下8.0 mm）和中腦被蓋部腹側(cè)區(qū)（VTA，坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，中逢左旁開1.2 mm，硬膜下8.2 mm）為注射點(diǎn)，每點(diǎn)注射6-羥多巴（6-OHDA）4μL（2 μg/μL， Sigma）。14 d后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡（1 mg/kg，Sigma）后，誘發(fā)大鼠產(chǎn)生向左旋轉(zhuǎn)行為，記錄30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，恒定向左轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速≥210 r/30 min定為成功的PD模型。行為學(xué)檢測(cè)成功的PD模型60只（其中6只大鼠未達(dá)到PD模型的要求，4只在手術(shù)過程中死亡）被選擇用于移植研究。

1.2.2 MAPCs的分離、培養(yǎng)：參考Snykers等[5]的方法獲取骨髓有核細(xì)胞。將分離出的骨髓有核細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)Buffer液制成細(xì)胞懸液分離MAPCs，使用CD45-Gly-A-磁珠分離法，具體步驟參考其使用手冊(cè)。將分離出的CD45-Gly-A-細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)六孔板內(nèi)，接種密度為5～10×103個(gè)CD45-Gly-A-細(xì)胞/mL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10% FCS、100 ng/mL LIF、100 U青霉素/mL和100 U鏈霉素/mL的L-DMEM。在第12天時(shí)向培養(yǎng)液中加入5μmol/L 5-溴-2-脫氧尿核苷（BrdUrd）。培養(yǎng)14 d后，培養(yǎng)細(xì)胞用0.25%胰酶室溫消化5 min，用PBS沖洗3次后制成細(xì)胞懸液。

1.2.3 動(dòng)物分組與處理：PD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=30）和MAPCs組（n=30）。MAPCs組：PD大鼠經(jīng)10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀，手術(shù)方法同PD模型制備，選取左側(cè)紋狀體2個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)（前囟后0.6 mm，矢狀縫右側(cè)4.0 mm，硬膜下5.0 mm）和（前囟前0.7 mm，矢狀縫右側(cè)3.0 mm，硬膜下5.0 mm），各注入制備的MAPCs懸液5μL（即每只鼠共移植2×105個(gè)細(xì)胞，注射速度為0.5μL/min，注射完畢留針（5 min），術(shù)后用牙科乳膠覆蓋鉆孔，縫合皮膚、筋膜，常規(guī)消毒。術(shù)后大鼠包被保暖清醒后置籠喂養(yǎng)，注意補(bǔ)水，并連續(xù)1周腹腔注射青霉素3萬U/d預(yù)防感染。對(duì)照組：操作過程與MAPCs組相同，在腦內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液兩處各5μL。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色：3個(gè)月后用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定大鼠，方法為：用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，剪開胸壁，暴露心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，用少量0.9%氯化鈉溶液（內(nèi)含0.01%的肝素）沖洗血管，隨即用冰冷的4%多聚甲醛灌注，灌注壓力略高于大鼠的收縮壓，即輸液瓶的液面距大鼠心臟約高1 m，灌注量為400～800 mL，1 h內(nèi)灌注完成，灌注后將取出的腦組織置于4%的多聚甲醛后固定3 h，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液洗滌后在70%酒精中過夜，次日經(jīng)升度酒精脫水（80%、90%、95%酒精各30 min，100%酒精30 min×2次），以損傷側(cè)的黑質(zhì)和紋狀體為中心制成標(biāo)準(zhǔn)石蠟包埋塊。然后在切片機(jī)上連續(xù)切成5μm厚的冠狀切片。切片用相應(yīng)的熒光染料染色后，在免疫熒光和共聚焦顯微鏡下識(shí)別MAPCs起源的細(xì)胞。染色步驟：石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后，在0.1% Triton X-100中孵育，室溫10 min；5%的羊血清孵育，室溫30 min；在I抗（NSE 1:500、BrdUrd 1:300或TH 1:200）中孵育，置于冰箱內(nèi)（4 ℃）濕盒中24 h；隨后在II抗（rhodamine、fluores-cein或CY2標(biāo)記的羊抗鼠IgG 1:100）中孵育1 h；上述每一步后均用PBS徹底洗滌（10 min×2次），成色反應(yīng)完成后經(jīng)PBS洗滌、脫水、透明和封片。

1.2.5 免疫電鏡染色：采用上述方法用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定大鼠，分離損傷側(cè)的黑質(zhì)和紋狀體并置于2.5%戊二醛緩沖固定液中，預(yù)固定5～10 min，待組織稍變硬后改為1 mm3大小，然后按以下步驟進(jìn)行：2.5%戊二醛緩沖固定液固定2h→0.1 mol/L PBS洗滌（20 min×2次）→振動(dòng)切片→ABC法染色→1%鋨酸后固定30～120 min→0.1 mol/L PBS洗滌→按50%、70%、90%乙醇、90%乙醇丙酮→90%、100%丙酮（5 min×2次）梯度脫水→丙酮和環(huán)氧樹脂1:1混合液浸透2 h→純環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h→包埋→聚合（80 ℃恒溫箱內(nèi)10 h）→修塊→超薄切片→染色（醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鋁雙重染色各10 min）→透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 MAPCs的體外培養(yǎng) 體外培養(yǎng)的CD45-GLY-A-細(xì)胞在14 d左右出現(xiàn)“集落樣”生長，細(xì)胞形態(tài)一致，成“類纖維樣細(xì)胞”形態(tài)。

2.2 MAPCs腦內(nèi)存活 MAPCs經(jīng)大鼠紋狀體定向注射3個(gè)月后。MAPCs移植組大鼠，免疫熒光雙重標(biāo)記顯示損傷側(cè)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)部分MAPCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞（MAPCs標(biāo)記物BrdUrd染色陽性，綠色；神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物NSE染色陽性，紅色）（圖1A）。MAPCs移植組大鼠，免疫熒光雙重標(biāo)記顯示損傷側(cè)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)部分MAPCs分化為多巴胺能神經(jīng)元（MAPCs標(biāo)記物BrdUrd染色陽性，綠色；多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物TH染色陽性，藍(lán)色）（圖1B）。對(duì)照組大鼠損傷側(cè)腦組織未發(fā)現(xiàn)BrdUrd染色陽性細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物NSE染色陽性（圖1C）。對(duì)照組大鼠損傷側(cè)腦組織未發(fā)現(xiàn)BrdUrd染色陽性細(xì)胞，多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物TH染色陽性（圖1D）。

圖1 MAPCs（5×106）移植入6-羥多巴誘導(dǎo)的PD大鼠體內(nèi)3個(gè)月后腦組織的免疫熒光染色分析（A.×200；B.×200；C.×100；D.×100）

2.3 免疫電鏡染色 電鏡下，在黑質(zhì)和紋狀體區(qū)可觀察到MAPCs來源的神經(jīng)細(xì)胞與其他神經(jīng)細(xì)胞形成了突觸聯(lián)系（圖2A-D）。

圖2 移植側(cè)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)MAPCs分化的TH陽性細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（A.×1000；B-D.×10000）

3 討論

PD為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的退行性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性變性壞死及其支配的紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)匱乏為病理特征[6]。在PD的治療中，藥物治療有不良反應(yīng)，且5～10年后療效明顯下降[7]?，F(xiàn)有的常規(guī)治療手段無法阻止多巴胺能神經(jīng)元的繼續(xù)喪失。細(xì)胞移植有望補(bǔ)充和替代PD患者腦中喪失的多巴胺能神經(jīng)元。相繼有胎腦黑質(zhì)組織[8]、腎上腺髓質(zhì)[9]、神經(jīng)干細(xì)胞[10]、ES細(xì)胞[11]移植治療PD的報(bào)道。但由于取材困難、來源不足、倫理限制、免疫排斥、體外增殖能力差或神經(jīng)分化效率低等方面的問題而阻礙這些細(xì)胞移植治療在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此，尋找最佳的移植細(xì)胞就成了醫(yī)學(xué)界在干細(xì)胞研究方面的重點(diǎn)之一。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）由于取材簡單、體外增殖能力強(qiáng)、神經(jīng)分化效率高、自體移植不受倫理學(xué)和免疫排斥的限制等優(yōu)點(diǎn)而成了目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[12-14]，作為BMSCs的亞群細(xì)胞之一，MAPCs更具有無以比擬的優(yōu)點(diǎn)而受到醫(yī)學(xué)界的極大關(guān)注[15]。

本研究中，MAPCs經(jīng)立體定向移植大鼠患側(cè)紋狀體后，可以在腦組織局部較長時(shí)間內(nèi)存活，并在黑質(zhì)和紋狀體區(qū)富集并高效率地分化為多巴胺能神經(jīng)元；這些資料表明MAPCs分化的多巴胺能神經(jīng)元能與腦組織相整合，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，使受損的神經(jīng)環(huán)路得以重建。電鏡觀察中，我們發(fā)現(xiàn)MAPCs分化的部分TH+細(xì)胞伸出突起并與其他神經(jīng)細(xì)胞建立了突觸聯(lián)系。當(dāng)然，神經(jīng)細(xì)胞分化或神經(jīng)環(huán)路的重建并非神經(jīng)功能恢復(fù)的先決條件之一，我們認(rèn)為更為合理的解釋是MAPCs與宿主腦組織的相互作用導(dǎo)致了某些營養(yǎng)因子的分泌，而這些因子正是神經(jīng)功能缺損得以恢復(fù)的主要原因。不過，細(xì)胞環(huán)路重建以及細(xì)胞間的電生理變化也是一個(gè)重要的原因，我們將就移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞間的直接電生理變化關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

相對(duì)于其他已知的干細(xì)胞，MAPCs來源豐富、取材簡單、容易分離純化培養(yǎng)，在合適的培養(yǎng)條件下體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，可達(dá)100代以上，細(xì)胞不發(fā)生分化和衰退。從PD病人骨髓來源的MAPCs經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與正常MAPCs具有相似的形態(tài)和分化能力，分化成多巴胺能細(xì)胞的能力沒有下降[16]，同時(shí)MAPCs也適合作為基因治療載體[17]，攜帶酪氨酸羥化酶（TH）基因的MAPCs可以在腦內(nèi)產(chǎn)生更高濃度的多巴胺。 MAPCs具有與胚胎干細(xì)胞相似的特性，同時(shí)又克服了倫理學(xué)的限制，可為干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究的突破帶來希望。

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