吳淑珍，夏露，陳引蕾，龐玲霞

（1.溫州醫(yī)學院 基礎醫(yī)學實驗中心，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

人類X染色體有著獨特的遺傳方式，男性的基因組中呈單倍型形式存在，遺傳方式獨特——父親的等位基因只能遺傳給女兒，所以它具有一些常染色體遺傳標記所無法比擬的優(yōu)點，特別適用于法醫(yī)學實踐中在父母缺如情況下姐妹之間的同胞親緣鑒定，這種獨特的遺傳方式已引起了一些法醫(yī)工作者的注意[1-2]。對浙江畬族常染色體的STR基因座的遺傳多態(tài)性已有研究[3]，但有關X染色體STR基因座的多態(tài)性資料鮮見。由于同樣的遺傳標記在不同的群體中，其遺傳多態(tài)性是不同的，為了觀察浙江畬族群體中X-STR基因座的遺傳多態(tài)性，我們對浙江畬族的DXS7132、DXS6804、DXS6799、DXS9898基因座進行遺傳學調查，并結合本實驗室對其他民族研究的數(shù)據(jù)庫進行分析，為研究中華民族群體起源、人群遺傳差異、法醫(yī)學個體識別等提供基礎資料。

1 對象和方法

1.1 對象 樣本的采集根據(jù)知情同意的原則，260份（女145，男115）畬族血樣取自無血緣關系且3代內(nèi)無族外通婚的浙江景寧畬族個體。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取：血液樣本采用EDTANa2抗凝，Chelex-100快速法[4]提取DNA。

1.2.2 引物序列：DXS7132、DXS6804、DXS6799、DXS9898 4個基因座的引物序列參照基因組數(shù)據(jù)庫（www.gdb.org）， 基本信息見表1，由上海捷瑞生物工程公司合成。引物序列見表2。

表1 浙江畬族四個X-STR基因座的特性

表2 浙江畬族四個X-STR基因座的引物序列

1.2.3 PCR擴增條件：PCR反應采用PC-818型基因擴增儀，總反應體系為20μL，反應管混合物中含10×緩沖液2.0μL，20μmol/L 引物0.2μL，25 mmol/L MgCl21.2μL，加入2.0μL模板DNA上清液（1 ng～1μg），1.0 U Taq酶，補水11.6 μL，冰上無菌操作。擴增條件：94 ℃變性5 min，然后94 ℃變性35 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次后，72 ℃保持10 min，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳：采用6%聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis=29:1，C=5%）分型，凝膠板厚0.6 cm，長19 cm，寬12 cm，恒電壓500 V，泳動1.5 h，銀染檢測，檢測結果用數(shù)碼相機拍照保存在電腦中。

1.2.5 等位基因分型標準物的制備[5]：采用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）-切膠回收-二次PCR-測序的方法制備X-STR基因座等位基因分型標準物，并以測序結果按重復單位重復次數(shù)命名等位基因。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理：對每個樣品逐個分型并記錄基因型。在Internet網(wǎng)上Promage公司網(wǎng)站http://www.proage.com/geneticidtools/powerstates/Power State Software 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得出各基因座的等位基因及基因型頻率、觀察雜合度（heterozygosity，HO）、個體識別力（power of discrimination，PD）、多態(tài)信息含量（polymorphism information contene，PIC），按文獻[6-7]計算男性單倍型頻率、基因多樣性、個體識別力。

2 結果

2.1 浙江畬族群體4個X染色體基因座基因頻率分布、群體遺傳學指標 見表3-6。

表3 浙江畬族四個X-STR基因座的等位基因分布頻率

2.2 基因座測序結果 見圖1-4。

表4 浙江畬族女性群體四個X-STR基因座的等位基因分布頻率

表5 浙江畬族男性群體四個X-STR基因座的單倍型分布

接上表

表6 浙江畬族四個X-STR基因座的等位基因群體統(tǒng)計數(shù)據(jù)

圖1 DXS7132基因座的核心序列為[GATA]，含等位基因12的測序結果

圖2 DXS6804基因座的核心序列為[TATC]，含等位基因11的測序結果

圖3 DXS6799基因座的核心序列為[TATC]，含等位基因11的測序結果

圖4 DXS9898基因座的核心序列為[TATC]，含等位基因8.3的測序結果

3 討論

長期以來人類起源、進化和遷移的研究是通過經(jīng)典的考古學、語言學以及形態(tài)學等方法實現(xiàn)的。分子生物學研究的引入，為我們了解人類群體和個體間的關系提供了有力的工具，通過對DNA的分析可以對人類的起源及群體的遷移狀況進行研究。因浙江畬族主要居住在浙江省景寧自治縣及周邊的縣市，這些居住地主要是山區(qū)，人口流動少，相對封閉，所以基因型的遺傳相對比較保守，是我們研究群體遺傳學比較難得的寶貴資源。

由于人類X染色體有著獨特的遺傳方式，在男性的基因組中呈單倍型形式存在，父親的等位基因只能遺傳給女兒，所以它具有一些常染色體遺傳標記所無法比擬的優(yōu)點。我們選擇了DXS7132、DXS6804、DXS6799、DXS9898基因座對浙江畬族進行了基因型分布的研究，獲得這四個基因座的群體遺傳學數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)，四個基因座的基因型分布均符合Hardy-Weignberg平衡，男性個體單倍體的多樣性為0.9878，除DXS6799基因座外，其他3個基因座的多態(tài)信息含量均大于0.6195（該值大于0.5有高度可提供信息性）[8]。聯(lián)合應用這4個基因座，有較高的識別能力和遺傳穩(wěn)定性，為研究畬族群體的起源、人群遺傳差異、法醫(yī)學個體識別等提供基礎資料。

雖然X染色體STR基因座具有高度的多態(tài)性，但在鑒定中只能起到排除作用，要作出肯定的結論，必須與常染色體、Y染色體的多態(tài)性標記相結合。

將本研究結果與其他民族、地區(qū)人群的數(shù)據(jù)比較，DXS7132基因座在匈牙利人群中檢出等位基因11與19[9]，在阿爾及利亞人群中檢出等位基因11[10]，DXS9898基因座在朝鮮人群中檢出等位基因0a與等位基因16[11]，在葡萄牙人群中檢出的等位基因型與本研究結果一致[12]。

[1] Szibor R, Krawczak M, Hering S, et al. Use of X-linked markers for forensic purpose[J]. Int J Legal Med,2003,117(2):67-74.

[2] 呂德堅,劉秋玲.X染色體STR的法醫(yī)學應用進展[J].中國法醫(yī)學雜志,2002,17(4):252-255.

[3] 何吉,許先國,傅啟華,等.浙江畬族和漢族人群六個短串聯(lián)重復系列位點遺傳多態(tài)性的研究[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2003,20(3):250-252.

[4] Gehrig C, Hochmeister M, Borer UV,et al. Swiss Caucasion population data for 13 STR loci using AmpFISTR profiler plus and cofiler PCR amplification kits [J].Forensic Sci,1999,44(5):1035-1038.

[5] 吳淑珍,夏露,張洪勤.用PCR-PAGE切膠回收-PCR測序法制備DXS9898基因座等位基因分型標準物[J]. 溫州醫(yī)學院學報,2009,39(5):460-461,463.

[6] 伍新堯.高級法醫(yī)學[M].鄭州:鄭州大學出版社,2002:296.

[7] 應斌武,石美森,鄧建強,等. DXS6804/ DXS9896/ GATA144D04基因座在中國漢族群體中的遺傳多態(tài)性及其法醫(yī)學應用[J].遺傳,2004,26(5):603-606.

[8] Nakamura Y, Leppert M, Oconnell P, et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping[J].Science,1987,235(4796):1616-1622.

[9] Zalan A, Volgyi A, Jung M, et al. Hungarian population data of four X-linked markers: DXS8378, DXS7132, HPRTB,and DXS7423[J].Int J Legal Med,2007,121(1):74-77.

[10] Bekada A, Benhamamouch S, Boudjema A,et al.Analysis of 21 X-chromosomal STRs in an Algerian population sample[J].Int J Legal Med,2010,124(4):287-294.

[11] Lee HY, Park MJ, Jeong CK,et al.Genetic characteristics and population study of 4 X-chromosomal STRs in Koreans:evidence for a null allele at DXS9898[J].Int J Legal Med,2004,118(6):355-360.

[12] Pereira R, Gomes I, Amorim A, et al. Genetic diversity of 10 X chromosome STRs in northern Portugal [J].Int J Legal Med,2007,121(3):192-197.