張瓊敏，鄭靜，宋攀攀，朱翌，陳曉云，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

位于高度保守的12S rRNA基因解碼區(qū)的同質(zhì)性A1555G和C1494T突變可導(dǎo)致其攜帶者對氨基糖甙類藥物超敏感[1-4]。開展線粒體DNA A1555G和C1494T突變篩查，可從根本上減少對氨基糖甙類藥物敏感的個(gè)體發(fā)生藥物性耳聾。外周血作為基因檢測的主來樣本來源，具有基因含量豐富、存儲(chǔ)方便等優(yōu)點(diǎn)，然而抽血是有侵入性的操作，并且需要相應(yīng)的人力物力才能完成。如果以血液作為唯一的基因來源勢必會(huì)給基因篩查的實(shí)驗(yàn)研究及臨床運(yùn)用造成諸多不便。那么簡易無損的口腔黏膜拭子是否可以取代血液完成藥物性致聾基因的檢測？其成功率與可靠性如何？本實(shí)驗(yàn)做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 對象及材料 溫州特殊教育學(xué)校非綜合征型耳聾學(xué)生97例（男57例，女40例，平均年齡13歲）。取被檢者口腔黏膜拭子3根于信封中室溫貯存，并取靜脈血2 mL，EDTA抗凝于冰箱4 ℃貯存。以上工作均按照溫州醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)管理規(guī)定，在患者及其家屬成員簽定知情同意書下完成。

1.2 試劑與器材 細(xì)胞裂解液（10 mmol/L Tris·HCl、1 mmol/L EDTA、0.1% SDS）、蛋白酶K、冰醋酸鉀（3 mol/L KAC、5 mmol/L CH3COOH）、異丙醇、75%酒精，QIAamp DNA Mini Kit（50）（德國QIAGEN生物公司），Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（大連寶生物工程有限公司），TaKaRa Ex Taq（大連寶生物工程有限公司），DL2，000TMDNA Marker（大連寶生物工程有限公司），Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（大連寶生物工程有限公司），引物合成由大連寶生物工程有限公司完成。MyCycler Thermal Cycler 170-9703 PCR 擴(kuò)增儀（BIO-RAD公司），DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀（北京六一儀器廠），Gene Genius Bio imaging sys-tem紫外凝膠分析系統(tǒng)（SynGene公司），Thermo Scientific nanodrop2000spetrophotometer超微量分光光度計(jì)（北京星越生物科技有限公司），所有測序工作均由北京華大基因公司完成。

1.3 方法

1.3.1 口腔拭子的獲?。喝?根普通醫(yī)用消毒棉簽反復(fù)刮拭受檢者面頰內(nèi)壁黏膜6次（受檢者30min內(nèi)未進(jìn)食），空氣中干燥后貯存于干凈的信封中室溫保存。

1.3.2 口腔拭子DNA的提取：手工法：用消毒后的鑷子將風(fēng)干的口腔拭子表面的硬質(zhì)棉花撕脫，置于2 mL的EP管中，加入600 mL細(xì)胞裂解液及3 mL蛋白酶K混勻，放入55 ℃的恒溫水浴箱中孵育90 min，加入600 mL -20 ℃預(yù)冷的冰醋酸鉀，顛倒混勻，冰浴10 min，4 ℃離心（12500 r/min，10 min），將上清液移至裝有600 mL預(yù)冷的異丙醇的EP管中并混勻。置于-20 ℃的冰箱中30 min，常溫離心（12500 r/min，20 min），棄去上清液。加入600 mL 75%乙醇，小心吹打混勻，離心（12500 r/min，7 min），棄去上清液，靜置干燥待酒精揮發(fā)至無味時(shí)加入20 mL高壓去離子水。

試劑盒法：按QIAampDNA mini Kit（50）試劑盒的說明書要求提取DNA。

1.3.3 靜脈血DNA的提?。喊碩AKERA DNA EXTRACTION KIT試劑盒說明書提取。

1.3.4 口腔拭子及靜脈血DNA濃度及純度的測定：用超微量分光光度計(jì)測定DNA溶液的A260值及A260/A280值來衡量DNA的濃度及純度。

1.3.5 基因擴(kuò)增：使用Primer 5.0軟件和Oligo7.0軟件根據(jù)人類線粒體基因序列（GenBank登錄號：AC_000021）設(shè)計(jì)引物Mit-2F、Mit-2R。上游引物5’-CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT-3’，下游引物5’-TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA-3’，引物由大連寶生物公司合成。Mit-2F、Mit-2R用于擴(kuò)增包含A1555A及C1494C野生型位點(diǎn)的線粒體基因。在25 mL反應(yīng)體積中，取口腔黏膜拭子或全血的樣品DNA 25 mL，10 mmol/L引物正反向各0.2 mL，0.2 mmol/L d-NTP 2 mL，10×PCR緩沖液2 mL，25μmol/L MgCl21.5 mL，5 U/mL Taq酶0.1 mL，ddH2O 18 mL。PCR儀上94 ℃ 5 min熱變性后，94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延長10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.3.6 測序及數(shù)據(jù)分析：口腔拭子及靜脈血DNA的PCR產(chǎn)物送上海華大基因公司直接測序，測序結(jié)果使用Gentle軟件與人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列校正后的人類線粒體DNA劍橋參考序列（Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence，Last updated 2008-2-16）進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)A1555G及C1494T的突變后用Chromas 2.0軟件讀取測序結(jié)果的峰圖文件，進(jìn)行確認(rèn)或排除。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 3組DNA濃度及純度數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)及卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度及純度 采用手工法提取的口腔拭子DNA量與使用試劑盒法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而手工法提取的DNA純度指標(biāo)A260/A280低于使用試劑盒法，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。試劑盒法與手工法提取的基因組DNA的PCR成功率與外周血差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同樣本來源的DNA濃度、純度及PCR成功率

2.2 口腔拭子及靜脈血DNA PCR產(chǎn)物的電泳條帶比較 靜脈血及口腔拭子的擴(kuò)增產(chǎn)物均停留在802 bp附近，且擴(kuò)增效果一致，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 口腔拭子及靜脈血DNA PCR產(chǎn)物送測結(jié)果及峰圖 口腔拭子DNA的PCR產(chǎn)物完全符合測序?qū)δ０宓囊螅?7例均可得出測序結(jié)果峰圖。兩組樣本的測序結(jié)果相一致，均顯示A1555G突變陽性2例，陰性95例。C1494T突變97例均為陰性。

口腔拭子DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的測序峰如圖2。圖2A顯示的是靜脈血DNA擴(kuò)增產(chǎn)物測定為A1555G突變陽性的耳聾患者的口腔拭子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖2B顯示的是A1555G突變陰性的耳聾患者的口腔拭子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖2C顯示的是C1494T突變陽性耳聾患者的測序峰圖（本研究試驗(yàn)結(jié)果中無陽性結(jié)果，僅作對比參考），圖2D顯示的是C1494T突變陰性的耳聾患者的口腔拭子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的結(jié)果判定圖

3 討論

近年來，基因檢測技術(shù)發(fā)展頗為迅速，而在樣本取材（DNA來源）上卻鮮有突破性的進(jìn)展。血液中的病原體有潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)。抽血給許多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區(qū)傳遞樣本時(shí)也存在一定的麻煩。此外抽血的高成本費(fèi)用成為基因檢測普及的制約因素[5]。目前，國內(nèi)尚無報(bào)道采用血液以外的其他樣本作為致聾基因檢測的DNA來源的研究。因此，迫切需要一種簡便無損的基因獲取方法以滿足對耳聾基因突變進(jìn)行檢測乃至廣泛篩查的需要。國內(nèi)外科研力量也在提取DNA方面不斷的嘗試尋求可以取代血液的其他生物檢材，如采用脫落的口腔黏膜上皮、毛囊、精液等各種可能含有DNA的人體檢材[6-7]。在口腔黏膜上皮的收集方式上，文獻(xiàn)[8]報(bào)道過口腔細(xì)胞刷、口腔黏膜拭子、牙簽、漱口等多種方式。其中漱口法的DNA產(chǎn)量是相對最高的[9]，但是樣本的處理卻相對麻煩[10]?？谇火つな米尤〔募皹颖咎幚磉^程都更為簡易，故本研究采集患者的口腔黏膜拭子，通過簡單又相對無毒性的細(xì)胞裂解法及試劑盒法提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)并測序。

口腔拭子是否可以取代血液成為DNA來源，關(guān)鍵在于其樣本的儲(chǔ)存穩(wěn)定性及可提取的DNA的量和純度是否滿足PCR的要求。相關(guān)研究已表明風(fēng)干后的口腔黏膜上皮標(biāo)本在室溫儲(chǔ)藏條件下2周內(nèi)會(huì)一直保持穩(wěn)定的狀態(tài)[10]。并且樣本DNA的產(chǎn)量與一定期限內(nèi)的儲(chǔ)存時(shí)間并不存在明顯的相關(guān)性[1-4]。分析本研究結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)口腔拭子中提取的DNA的PCR成功率與血液DNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩種方法提取的DNA基本都可以滿足藥物性致聾基因的擴(kuò)增。其中失敗的手工法2例及試劑盒法3例的DNA濃度均小于10 ng/mL，可能是濃度過低引起PCR的失敗。從表1也可以看出單根口腔拭子提取的DNA產(chǎn)量波動(dòng)性是較大的，這是由單根拭子口腔上皮細(xì)胞的采集不可量化而造成的結(jié)果?？梢酝ㄟ^同時(shí)提取數(shù)根口腔拭子DNA來避免波動(dòng)性過大引起的產(chǎn)量過低的問題。DNA獲得成功擴(kuò)增的口腔拭子的測序結(jié)果與相應(yīng)的血液的結(jié)果完全符合，說明采用口腔拭子進(jìn)行基因檢測結(jié)果是完全可靠的。另外，通過對兩種口腔黏膜拭子DNA提取方法的比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法所提取的DNA純度較手工法高，但是價(jià)格昂貴，平均每根口腔拭子成本為30元人民幣，而手工法每根成本僅為3元人民幣。從利于藥物性耳聾基因檢測的普遍開展的角度出發(fā)，手工法提取口腔拭子DNA更適宜。

本項(xiàng)對比研究結(jié)果表明口腔黏膜拭子據(jù)有操作簡單、價(jià)格低廉的優(yōu)勢，可以代替靜脈血成為基因組DNA的另一來源途徑，并可以其無損傷性應(yīng)用于新生兒、精神病人及不愿意提供血液人群的藥物性耳聾基因的檢測，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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