師永霞，黃吉城，蘇錦坤，李小波，幸蘆琴，鄭 夔，洪 燁，郭波旋

1例國內(nèi)罕見的輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室檢測＊

師永霞，黃吉城，蘇錦坤，李小波，幸蘆琴，鄭 夔，洪 燁，郭波旋

目的 對1例輸入性疑似瘧疾患者的血樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。方法 制備疑似瘧疾患者血樣的血涂片，吉姆薩染色后進(jìn)行瘧原蟲的鏡檢觀察。利用實(shí)驗(yàn)室自行研制的瘧原蟲屬特異性（通用型）和4種瘧原蟲種特異性的巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，對該血樣進(jìn)行瘧疾檢測及分型。將PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測定，并與已知的卵形瘧序列進(jìn)行blast比對分析。結(jié)合血樣的分子生物學(xué)檢測結(jié)果，重新對鏡檢結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。結(jié)果 血樣初次鏡檢為瘧疾陰性。使用瘧原蟲巢式PCR通用引物對血樣的DNA進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增出了預(yù)期大小約240bp的條帶；巢式PCR分型檢測表明，血樣僅擴(kuò)增出預(yù)期大小約450bp的卵形瘧條帶，無對應(yīng)大小的惡性瘧、間日瘧和三日瘧擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。瘧原蟲通用型和卵形瘧特異性的熒光PCR檢測結(jié)果均為典型的S形陽性曲線，卵形瘧擴(kuò)增片段的熔解溫度為72.5℃。序列分析表明，擴(kuò)增片段長度為434bp，blast比對發(fā)現(xiàn)去除引物后的393個(gè)堿基與GenBank DQ845247等卵形瘧的SSU rRNA對應(yīng)部分的基因序列同源性為100%。重新對血涂片進(jìn)行鏡檢復(fù)核，結(jié)果在薄血膜中發(fā)現(xiàn)了卵形瘧的環(huán)狀滋養(yǎng)體，被寄生的紅細(xì)胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀。結(jié)論 使用巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、序列分析和鏡檢等方法，證實(shí)該例輸入性的疑似瘧疾患者為卵形瘧原蟲感染。

輸入性卵形瘧；鏡檢；巢式PCR；實(shí)時(shí)熒光PCR；序列分析

卵形瘧原蟲感染經(jīng)常發(fā)生在中東、西非和印度尼西亞等地，在東南亞泰緬邊界和孟加拉國境內(nèi)也有卵形瘧的發(fā)病報(bào)道［1－3］。我國本土瘧疾以間日瘧為主，其次是惡性瘧，三日瘧偶爾可見，卵形瘧已無報(bào)告。卵形瘧原蟲感染者血中蟲體數(shù)量少，在厚血膜中易與間日瘧和三日瘧原蟲混淆，不易識別，僅有薄血片可用于形態(tài)學(xué)診斷，所以使用傳統(tǒng)的吉姆薩染色觀察法進(jìn)行鏡檢時(shí)易對卵形瘧原蟲感染漏檢［4］。本研究將傳統(tǒng)鏡檢法與巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR等分子生物學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合，對一例國內(nèi)罕見的輸入性卵形瘧原蟲感染進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 入境旅客卞某的EDTA抗凝血樣，4℃保存。該旅客在赤道幾內(nèi)亞國家工作兩年，期間染瘧疾，曾多次反復(fù)發(fā)作，入境時(shí)查體為38.3℃。

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Extraction Minikit）和SYBR熒光PCR試劑（QuantiTect SYBR Green PCR Kit）購自 Qiagen公司，探針法熒光PCR試劑（TaqMan○RFast U－niversal PCR Master Mix（2×）購自ABI公司，Taq酶購自Roche公司，100bp DNA Ladder Marker和瓊脂糖購自TaKaRa公司，吉姆薩染色液購自珠海貝索生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)瘧原蟲的小亞單位核糖體核糖核酸 （small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因序列［5］，設(shè)計(jì)了瘧原蟲屬特異性和四種瘧原蟲種特異性引物和探針，序列見表1，用于瘧疾巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測及分型。合成上下游引物間的DNA片段作為PCR擴(kuò)增時(shí)的陽性對照。引物、探針和DNA片段委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 瘧原蟲檢測的引物和探針Table 1 Primers and probes used to detect Plasmodium

1.2.2 巢式PCR 設(shè)反應(yīng)總體系25μL，PCR第1次擴(kuò)增體系包括 PCR buffer 2.5μL、10μmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 引 物 rPLUout－FP 和rPLUout－RP各0.5μL、Taq酶0.25μL、無菌雙蒸水15.75μL、DNA模板5μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；4℃。巢式PCR第2次擴(kuò)增體系包括PCR buffer 2.5μL、10μmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 通用型上下游引物rPLUin－FP、rPLUin－RP各0.5μL或4種瘧原蟲特異性上下游引物各0.5μL、Taq酶0.25μL、無菌雙蒸水18.75μL以及2μL第1次PCR產(chǎn)物；同時(shí)設(shè)立陰性和陽性對照，陰性對照使用無菌水，陽性對照使用合成的瘧疾DNA片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min；94℃1min，58℃1 min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 瘧原蟲通用熒光PCR檢測采用探針法進(jìn)行，反應(yīng)總體積20μL，包括Master Mix 10μL、10μmol/L 引 物 Plas－FP 和Plas－RP各 1μL、5μmol/L 探針 Plas－Pro 1μL、DNA 7μL，同時(shí)分別以DEPC H2O和DNA陽性模板作為陰性和陽性對照。擴(kuò)增和檢測在ABI 7900HT Fast熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃20s；95℃1s，58℃20s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)。采用染料摻入法進(jìn)行卵形瘧的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，反應(yīng)體系為25μL，包括2×PCR buffer 12.5μL、10μmol/L上下游引物OVA－FP和OVARP各0.75μL、DEPC H2O 9μL以及瘧原蟲模板DNA 2μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15 min；94℃15s，50℃30s，72℃30s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)；最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析 取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GelGreen染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 序列測定和分析 擴(kuò)增的PCR片段由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，再對堿基組成進(jìn)行blast比較分析。使用DNASTAR軟件對該序列與其他卵形瘧序列進(jìn)行比對并進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié) 果

2.1 血樣的鏡檢分析 制備血樣的厚血膜和薄血膜涂片，吉姆薩染色后進(jìn)行油鏡觀察。初次鏡檢判斷為陰性，復(fù)核時(shí)在薄血膜中發(fā)現(xiàn)了卵形瘧的環(huán)狀滋養(yǎng)體，被寄生的紅細(xì)胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀（圖1）。

圖1 血涂片吉姆薩染色鏡檢觀察Fig.1 Microscopic observation of Giemsa stained blood smears.

2.2 血樣的巢式PCR檢測 提取血樣的DNA進(jìn)行瘧疾的通用型和特異性的巢式PCR檢測，結(jié)果如圖2和圖3。使用瘧疾的通用引物PCR擴(kuò)增出了預(yù)期大小約240bp的條帶（圖2），使用卵形瘧的特異性引物PCR擴(kuò)增出了預(yù)期大小約450bp的條帶（圖3），惡性瘧、間日瘧和三日瘧引物對沒有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。

2.3 血樣的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 瘧原蟲屬特異性的熒光PCR檢測結(jié)果顯示（見圖4），血樣擴(kuò)增出了典型的S形曲線，為瘧疾陽性。進(jìn)一步的瘧原蟲特異性熒光PCR檢測結(jié)果表明，該患者為卵形瘧感染（圖5），擴(kuò)增片段的Tm值為72.5℃（圖6）。

2.4 擴(kuò)增片段的序列分析 將輸入性卵形瘧的巢式PCR擴(kuò)增片段送去測序。序列分析表明，擴(kuò)增片段長度為434bp，將該序列遞交到GenBank上，GenBank登錄號為JF505386。blast比對發(fā)現(xiàn)去除引物后的393bp擴(kuò)增片段與卵形瘧SSU rRNA（GenBank 登 錄 號 為 DQ845247、AB182491、AB182492、AB182493、AJ001527和 X99790）對應(yīng)部分的基因序列同源性為100%。

3 討 論

為了響應(yīng)聯(lián)合國千年發(fā)展目標(biāo)高級別會議提出的在全球根除瘧疾的倡議，衛(wèi)生部制定和頒布了“中國消除瘧疾行動(dòng)計(jì)劃（2010－2020年）”，但在我國，周邊的緬甸、老撾等東南亞國家和與我國直航的非洲等傳統(tǒng)瘧疾高發(fā)地區(qū)帶來的輸入性瘧疾疫情為我國瘧疾防治工作帶來日益嚴(yán)重的威脅。目前瘧疾診斷以鏡檢為主，它不但需要操作者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且有一定的局限性。當(dāng)血中原蟲密度較低（＜50個(gè)/μL）時(shí)，靠鏡檢難以查到原蟲，容易出現(xiàn)漏診［7］；由于國內(nèi)少見三日瘧和卵形瘧，容易將兩者誤判為形態(tài)和臨床癥狀相似的間日瘧和惡性瘧［1－2］；當(dāng)發(fā)生瘧原蟲混合感染時(shí)，容易出現(xiàn)誤診［8－10］；鏡檢耗時(shí)，不適用于大量人群的篩查。

本研究對一例來自非洲赤道幾內(nèi)亞國家的入境、疑似瘧疾旅客的血樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測。血涂片初次鏡檢結(jié)果為瘧疾陰性，但該血樣的屬特異性巢式PCR和屬特異性的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測均為瘧原蟲核酸陽性。進(jìn)一步的種特異性巢式PCR檢測發(fā)現(xiàn)，血樣擴(kuò)增出了卵形瘧預(yù)期大小約450bp的條帶，無其它種類瘧原蟲混合感染。利用染料摻入法進(jìn)行卵形瘧的特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，血樣的檢測結(jié)果為卵形瘧陽性，擴(kuò)增片段特異性好，Tm為72.5℃。序列分析表明，雖然用于PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物的序列與GenBank DQ845247、AB182491等卵形瘧對應(yīng)部分分別有3個(gè)和1個(gè)堿基不同，但去除引物后的擴(kuò)增片段堿基組成與上述卵形瘧的序列完全相同，這證實(shí)了該例瘧疾為輸入性卵形瘧，說明在非洲中西部國家有卵形瘧的分布。隨后，我們對血涂片進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果在薄血膜中發(fā)現(xiàn)了卵形瘧的環(huán)狀滋養(yǎng)體，形態(tài)與間日瘧相似；被寄生的紅細(xì)胞為橢圓形，邊緣呈傘矢狀。這表明使用傳統(tǒng)的鏡檢法易對卵形瘧原蟲感染漏檢，與Win等研究結(jié)果相似［1］。

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Laboratory diagnosis of a suspected case of importedPlasmodiumovaleinfection

SHI Yong－xia，HUANG Ji－cheng，SU Jin－kun，LI Xiao－bo，XING Lu－qin，ZHENG Kui，HONG Ye，GUO Bo－xuan

（HealthQuarantineLab，GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter，GuangdongEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Guangzhou510700，China）

Blood smear of suspected imported malaria patient was prepared and observed by microscopy after Giemsa staining.Initial microscopy of the blood sample was negative for malaria.Nested PCR and real－time PCR methods of genusspecificPlasmodiumand four species－specificPlasmodiumwere performed to detect and differentiate the parasites using inhouse designed primers and probes.Nested PCR with the genus－specific primers ofPlasmodiumshowed that the blood sample produced an expected band of about 240bp in size.Plasmodiumclassification demonstrated that the blood sample only produced an expected amplification band of about 450bp ofP.ovalein size and no bands ofP.falciparum，P.vivaxandP.malarie.Real time PCR with bothPlasmodiumand specificP.ovaledisplayed typical S－shaped positive curves.Sequence analysis showed that the amplified fragment was composed of 434bases and 393bases removing PCR primers showed 100%homology to the corresponding part ofP.ovaleSSU rRNA gene of GenBank accession number DQ845247.Blood smear was reviewed by microscopy.The ring trophozoites ofP.ovalewere founded in thin blood film and the parasitized cell was oval in shape with fimbriated edges.The suspected case of imported malaria patient was confirmed to infectP.ovaleby nested PCR，real－time PCR，sequence analysis and microscopic examination.

importedPlasmodiumovale；microscopic examination；nested PCR；real time PCR；sequence analysis

R382.3

A

1002－2694（2011）10－0914－04

＊廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2007GDK32）

師永霞，Email：syx0817＠yahoo.com.cn

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心衛(wèi)生檢疫實(shí)驗(yàn)室，廣州 510700

2011－06－21；

2011－08－03