曹芳芳，孟凡亮，喬 博，張茂俊，張建中

2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206

空腸彎曲菌AhpC蛋白的克隆表達(dá)及抗原性分析＊

曹芳芳1，孟凡亮2，喬 博2，張茂俊2，張建中2

目的 構(gòu)建空腸彎曲菌烷基過氧化氫還原酶（ahpC）基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，克隆表達(dá)AhpC蛋白，用Western blot以及ELISA方法檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗原性，為篩選空腸彎曲菌感染后特異性抗體檢測(cè)試劑的制備奠定基礎(chǔ)。方法 用PCR方法從中國(guó)分離菌株ICDCCJ07001的染色體DNA中擴(kuò)增出ahpC基因，將目的基因插入表達(dá)載體pGEX－4T－1后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGEX－ahpC的表達(dá)。SDS－PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，采用GST標(biāo)簽親和層析柱純化表達(dá)蛋白。應(yīng)用兔免疫血清、臨床感染者血清以及健康無感染者血清，利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步評(píng)價(jià)其在ELISA檢測(cè)方法中的應(yīng)用。結(jié)果 PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組表達(dá)蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定為空腸彎曲菌AhpC蛋白，Western blot及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示AhpC具有特異抗原性。結(jié)論 成功構(gòu)建了ahpC重組表達(dá)載體pGEX－4T－1/ahpC，并在大腸桿菌中高效表達(dá)?？漳c彎曲菌AhpC蛋白具有抗原性，可以作為空腸彎曲菌感染后血清抗體檢測(cè)的特異抗原。

空腸彎曲菌；克隆表達(dá)；AhpC；抗原性

2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京102206

空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni，C.jejuni）是一種微需氧，需要豐富營(yíng)養(yǎng)的彎曲菌屬?？漳c彎曲菌的感染是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家導(dǎo)致人類腹瀉的主要病原菌［1－2］?？漳c彎曲菌前期感染是常見的導(dǎo)致炎癥性神經(jīng)病的細(xì)菌，例如格林巴利綜合征（GBS）和fisher綜合征（MFS）［3］。三分之一格林巴利綜合征患者有空腸彎曲菌前驅(qū)感染［4］。雖然血清抗體的檢測(cè)結(jié)果通常不作為細(xì)菌感染的診斷指標(biāo)，但對(duì)于空腸彎曲菌感染導(dǎo)致GBS的病因分析具有重要價(jià)值。目前我國(guó)對(duì)于空腸彎曲菌血清特異抗體檢測(cè)的試劑缺乏，獲得高靈敏度、高特異度的空腸彎曲菌抗體的檢測(cè)抗原具有重要的價(jià)值。

本研究組前期研究以空腸彎曲菌的全菌可溶性蛋白作為抗原，應(yīng)用 Western－blot方法，發(fā)現(xiàn)AhpC蛋白可能具有抗原性，為進(jìn)一步確定AhpC蛋白的抗原性特征并初步評(píng)價(jià)其在ELISA檢測(cè)方法中的應(yīng)用，本研究擬用原核重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行AhpC蛋白的克隆表達(dá)，分析其重組蛋白的抗原性，并初步確定其在ELISA檢測(cè)方法中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料 空腸彎曲菌中國(guó)菌株ICDCCJ07001及質(zhì)粒pGEX－4T－1由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和保存；EX－Taq酶，限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI，T4DNA連接酶，Pmd18－T Vector，protein marker，均購(gòu)自大連TaKaRa公司；大腸桿菌E.coliDH5a，菌株E.coliBL21（DE3），Taq DNA聚合酶，dNTP，DNA marker，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DNA電泳瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；GST標(biāo)簽的快速親和層析柱購(gòu)自GE Healthcare公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記SPA（北京博奧森生物技術(shù)公司）；兔免疫血清（本科室制備）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司北京合成部完成，DNA測(cè)序由天一輝遠(yuǎn)公司完成，蛋白飛行質(zhì)譜鑒定由本實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR的擴(kuò)增 運(yùn)用SwissPrpt預(yù)測(cè)AhpC蛋白的信號(hào)肽，確定其存在信號(hào)肽的概率幾乎為0，Primer5.0設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)基因的引物。ahpC上游引物：5′－CGCGGATCCATGATAGTTACTAAAAAA GCTTTAGATTT－3′；下游引物：5′－CCGCTCGAG TTAAAGTTTAGCTTCGTTTTTGC－3′，分 別 插入BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工公司合成。

PCR擴(kuò)增體系為：75μL體系，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，然后按以下參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，最后72℃延伸5min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物75μL，1%的瓊脂糖凝膠（0.01‰GelRed染色），80V電泳50min，在凝膠電泳成像儀下切膠。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 用瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將膠回收的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pGEX－4T－1分別用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切，30μL酶切體系：PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體各20μL，10×buffer K 3μL，雙蒸水5μL；酶BamH I，XhoI各1μL。酶切條件：30℃1h；37℃3h。酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖切膠回收，利用普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。目的基因與表達(dá)載體以摩爾比6∶1的比例混合加入T4DNA連接酶16℃ 連接過夜。取連接產(chǎn)物1μL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)后挑選單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖床過夜，用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒的雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名pGEX－4T－1/ahpC。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)水平的鑒定將陽性克隆子菌落接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖至菌液濃度OD值約為0.6～1.0時(shí)加入終濃度0.5mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。用2只試管分別取菌液樣品1mL，用0.01mol/L的PBS洗菌2次，其中1管菌液超聲破碎處理；4 ℃，8 000r/min，離心30min，分離上清和沉淀，沉淀加入PBS懸浮；另一管菌液也加PBS懸?。簧锨?，沉淀，全菌蛋白各取30μL直接加4×蛋白上樣緩沖液10μL，跑SDSPAGE電泳，分析重組蛋白的存在狀態(tài)。

1.2.4 飛行質(zhì)譜蛋白鑒定 SDS－PAGE電泳后，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白做考染膠切點(diǎn)制備質(zhì)譜樣，用飛行質(zhì)譜鑒定克隆子表達(dá)蛋白的種類。AhpC蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果為空腸彎曲菌的烷基過氧化氫還原酶（AhpC）蛋白，其分子量約為22kD，其鑒定結(jié)果的可信度為100%。

1.2.5 Western－blot分析 表達(dá)產(chǎn)物用厚度為0.75mm的凝膠跑SDS－PAGE電泳，之后把準(zhǔn)備好的PVDF膜用甲醇活化40s，然后將凝膠，5層濾紙，PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡活化20min，至半干式電轉(zhuǎn)印儀25V轉(zhuǎn)印60min，用含0.1%Tween 20的TBS（TBST）洗膜3次，每次10min，然后轉(zhuǎn)入封閉液（1×TBS＋0.5%脫脂奶粉＋0.05%的Tween20）中，4℃封閉過夜；取出PVDF膜，用TBST洗膜3次，每次10min；加入1∶100的一抗反應(yīng)液（空腸彎曲菌免疫前、后兔血清）37℃緩慢搖動(dòng)孵育120min；取出PVDF膜用TBST洗膜3次，每次10min；加入1∶10 000的二抗反應(yīng)液（辣根過氧化酶標(biāo)記rSPA）37℃緩慢搖動(dòng)孵育60min；洗膜后加入DAB（6mg DAB、10μL H2O2、1×TBS稀釋至10mL）搖床上緩慢搖動(dòng)顯色1min，顯色后用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.2.6 ELISA方法檢測(cè)AhpC重組蛋白抗原特異度、靈敏度 利用上述方法獲得的AhpC重組蛋白抗原包被ELISA檢測(cè)板（每孔所含的蛋白為1μg），檢測(cè)空腸彎曲菌免疫前血清、免疫后血清以及其它病原免疫血清，包括幽門螺桿菌免疫血清、小腸結(jié)葉爾森氏菌免疫血清、大腸桿菌O157∶H7免疫血清、霍亂弧菌免疫血清。血清稀釋度分別為1∶100～1∶102 400。利用AhpC重組蛋白抗原包被ELISA檢測(cè)板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的12份空腸彎曲菌抗體陽性患者血清，17份空腸彎曲菌抗體陰性血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示AhpC基因的PCR產(chǎn)物大小在597bp左右，與AhpC的基因預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的AhpC基因一致，見圖1。

圖1 AhpC PCR擴(kuò)增凝膠電泳分析1.DNA 分 子 量 標(biāo) 準(zhǔn)；2－4.AhpC PCR 擴(kuò) 增 結(jié) 果（597bp）Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of AhpC PCR product1：DNA marker；2－4：PCR product of AhpC（597bp）

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)到大小為597bp的片段，證明ahpC－pGEX構(gòu)建成功，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果1.DNAmarker III，2.重組質(zhì)粒ahpC－pGEX雙酶切Fig.2 Identification of the recombinant plasmid1.DNAmarker III；2.recombinant ahpC－ pGEX digested by BamH I and XhoI

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌誘導(dǎo)前后表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE顯示，誘導(dǎo)的重組菌在約48kD處有一蛋白條帶，同預(yù)計(jì)的大小相吻合，而未誘導(dǎo)菌無此條帶，見圖3。

2.4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 AhpC蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果為所表達(dá)蛋白條帶為空腸彎曲菌的烷基過氧化氫還原酶（AhpC）蛋白，其分子量約為22kD，其鑒定結(jié)果的可信度為100%。

圖3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1.protein marker；2.空宿主菌 BL21的誘導(dǎo)；3.攜帶表達(dá)載體pGEX的宿主菌BL21的誘導(dǎo)；4.攜帶重組表達(dá)載體ahpC－pGEX的宿主菌BL21的未誘導(dǎo)；5.攜帶重組表達(dá)載體ahpC－pGEX的宿主菌BL21的誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的沉淀；6.攜帶重組表達(dá)載體ahpC－pGEX的宿主菌BL21的誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的上清；7.重組質(zhì)粒ahpC－PGEX表達(dá)純化后的蛋白。Fig.3 The expression product of the recombinant plasmid ahpC－PGEX1：Protein marker；2：the induction of BL21without PGEX；3：Expression product of induced PGEX in BL21；4：expression product of the ahpC－PGEX without induction in BL21；5：Precipitatant of induced BL21that transformed ahpC－PGEX；6：Supernatant of induced BL21that transformed ahpCPGEX；7：Purified protein of expression product of ahpC－PGEX in BL21

2.5 Western blot圖片 純化后的ahpC表達(dá)的蛋白作為抗原，一抗用3組6種血清，分別是從散發(fā)格林巴利綜合征患者分離到的空腸彎曲菌菌株免疫兔子得到的多抗血清，暴發(fā)格林巴利綜合征患者分離到的空腸彎曲菌菌株免疫兔子得到的多抗血清，普通腹瀉病病人分離到的空腸彎曲菌菌株免疫兔子得到的多抗血清，一抗的濃度1∶50；二抗用HRPSPA，濃度1∶10 000。

2.6 ELISA檢測(cè)結(jié)果 顯示克隆表達(dá)的空腸彎曲菌的AhpC蛋白作為抗原檢測(cè)空腸彎曲菌抗體具有較高的靈敏度和特異度。

2.6.1 AhpC抗原包被ELISA板對(duì)不同血清抗體檢測(cè)OD值 見表1、表2。

2.6.2 應(yīng)用AhpC重組蛋白抗原12份臨床陽性標(biāo)本血清，17份人群陰性血清進(jìn)行抗體檢測(cè)結(jié)果。

3 討 論

本研究建立了用pGEX－4t－1載體表達(dá)C.jICDCCJ07001的ahpC基因。Western－blot檢測(cè)rahpC的抗原性，以空的BL21宿主菌，含pGEX的BL21宿主菌作為陰性對(duì)照，ahpC的表達(dá)產(chǎn)物與GBS散發(fā)相關(guān)的空腸彎曲菌，與2007年吉林GBS暴發(fā)菌株ICDCCJ07001相關(guān)的空腸彎曲菌，及與普通腹瀉相關(guān)的空腸彎曲菌全菌的抗血清均起反應(yīng)，表明AhpC蛋白可能是空腸彎曲菌血清學(xué)診斷的候選抗原。

表1 AhpC抗原包被ELISA板對(duì)不同血清抗體檢測(cè)Table 1 OD value to AhpC antigen as ELISA of different serum antibodies test

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的Western－blot鑒定1.Protein marker；2.ICDCCJ07001全菌蛋白做陽性對(duì)照；3.散發(fā)GBS分離到的C.j免疫前兔血清；4.散發(fā)GBS分離到的C.j免疫后多抗兔血清；5.爆發(fā)GBS分離到的C.j ICDCCJ07001免疫前兔血清；6.爆發(fā)GBS分離到的C.j ICDCCJ07001免疫后多抗兔血清；7.普通腹瀉病人分離到的C.j免疫前兔血清；8.普通腹瀉病人分離到的C.j免疫后多抗兔血清；9.陰性對(duì)照。Fig.4 The results of Western－blot analysis1.Protein marker；2.Positive control；3.Blood serum of the rabbit before immunized by the C.jisolated from scattered GBS patient；4.Blood serum of the rabbit immunized by the C.jisolated from scattered GBS patient；5.Blood serum of the rabbit before immunized by the C.j isolated from outbreak GBS patient；6.Blood serum of the rabbit immunized by the C.j isolated from outbreak GBS patient；7.Blood serum of the rabbit before immunized by the C.jisolated from diarrhea patient；8.Blood serum of the rabbit immunized by the C.j isolated from diarrhea patient；9Negative control

研究表明，空腸彎曲菌因其與神經(jīng)組織具有相同或類似的抗原成分促使機(jī)體對(duì)抗原的錯(cuò)誤識(shí)別從而引起自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致GBS的發(fā)生［5］。因此，獲得能夠有效評(píng)價(jià)空腸彎曲菌感染后特異抗體水平的有效抗原，不僅可以進(jìn)行針對(duì)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)診斷，同時(shí)對(duì)于既往感染者血清抗體分布的流行病學(xué)研究以及進(jìn)一步探索空腸彎曲菌引起腸外感染的致病機(jī)制具有重要意義［6］。

表2 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of the detection of clinical samples

本研究對(duì)編碼空腸彎曲菌小分子外膜蛋白ahpC的基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定，所得序列與GenBank公布的ICDCCJ07001的ahpC序列一致性為100%；成功構(gòu)建重組表達(dá)載體ahpC－pGEX，經(jīng)過雙酶切及測(cè)序鑒定，結(jié)果與預(yù)測(cè)一致；經(jīng)42℃轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中；重組工程菌在37℃使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS－PAGE電泳可見相對(duì)分子質(zhì)量約為48kD的目的蛋白；經(jīng)超聲破菌和電泳分析，重組表達(dá)蛋白存在可溶性成分，經(jīng)蛋白飛行質(zhì)譜鑒定所得蛋白為烷基過氧化氫還原酶，用GST標(biāo)簽的親和層析柱純化得到重組蛋白，經(jīng)Western－blot檢測(cè)證明AhpC具有針對(duì)空腸彎曲菌抗體的特異的抗原性，同時(shí)標(biāo)簽蛋白谷胱甘肽（GST）經(jīng) Western－blot驗(yàn)證與空腸彎曲菌抗體不反應(yīng)，證明其沒有抗原性。本研究利用重組表達(dá)的AhpC蛋白作為ELISA抗原分別檢測(cè)了免疫血清以及實(shí)驗(yàn)室保存的空腸彎曲菌抗體陽性及陰性血清，同時(shí)檢測(cè)了其它腸道感染病原的免疫血清，證明AhpC重組蛋白針對(duì)空腸彎曲菌抗體均有較高的特異性，不與其它免疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)，100%（12/12）的陽性臨床患者血清獲得陽性結(jié)果，100%（17/17）的陰性血清獲得陰性結(jié)果，表明本研究獲得的AhpC蛋白具有檢測(cè)空腸彎曲菌血清抗體的特異的抗原性，可以作為檢測(cè)空腸彎曲菌抗體的候選抗原。作為診斷試劑其特異度、靈敏度可能需要增加樣本量繼續(xù)驗(yàn)證，但本研究的小樣本檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，其靈敏度、特異度均為100%。

AhpC是一種硫氧還原蛋白依賴的烷基過氧化氫還原酶，是抗氧化酶家族peroxire－doxins（prxs）的成 員 之 一［7］?？?氧 化 酶 家 族 peroxire－doxins（prxs）種類繁多，其功能除了抗氧化功能外，還可以調(diào)解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞的凋亡和分化［8］。其作用是通過在高氧化環(huán)境中還原有毒的氫化氧化物來實(shí)現(xiàn)的［3］。像空腸彎曲菌這樣的微需氧病原生物，AhpC蛋白是其能夠在有氧環(huán)境中生存的決定因素［2］。烷基過氧化氫還原酶是細(xì)菌清除活性氧（ROS）的一種主要成分，AhpC基因功能缺陷能導(dǎo)致多效的表型改變，包括形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面性質(zhì)的改變［9］。在多數(shù)細(xì)菌中，AhpC是雙組分系統(tǒng)，由蛋白AhpF和AhpC組成。AhpC在過氧化物還原酶活性中起主要作用［10］。本研究除了提示空腸彎曲的診斷抗原外，也為進(jìn)一步研究烷基過氧化氫還原酶的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Cloning，expression，purification and antigenicity analysis of AhpC inCampylobacterjejuni

CAO Fang－fang，MENG Fan－liang，QIAO Bo，ZHANG Mao－jun，ZHANG Jian－zhong

（SchoolofPublicHealth，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100730，China）

To clone and express the AhpC protein ofCampylobacterjejuniinE.coliand characterize its antigenicity and specificity.Theahpcgene was amplified by PCR fromC.jejeunistrain ICDCCJ07001，and cloned into pGEX－4T－1.The recombinant PGEX－4T－1－ahpCwas transformed toE.coliBL21（DE3）for protein expression.The expression product was analyzed and identified by SDS－PAGE and MALDI TOF－TOF 4700Proteomics Analyzer.The expressed protein was identified asCampylobacterjejuniAhpC protein by Proteomics Analyzer.Both Western blot and ELISA showed that AhpC had specific antigenicity forCampylobacterjejuni.The expression and purification of recombinant AhpC antigen with good antigenicity and specificity will facilitate the research and clinical application in the diagnosis ofC.jejuniinfection.

Campylobacterjejuni；cloning and expression；ahpC；antigenicity

R378

A

1002－2694（2010）10－0909－05

＊中國(guó)疾病預(yù)防控制中心青年基金 （2009A102）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81071314）

張茂俊，Email：zhangmaojun＠icdc.cn；

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100730；

2011－05－21；

2011－08－15