王婭娜，王 潔，王淑靜，張 焱，趙 巍

2.寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學與細胞生物學教研室；

3.寧夏回族自治區(qū)遺傳與生殖重點實驗室

細粒棘球蚴重組抗原rEgferritin誘導宿主抗感染免疫應答的初步研究＊

王婭娜1，2，3，王 潔1，王淑靜1，張 焱1，趙 巍1，2，3

目的 初步探討細粒棘球蚴重組鐵蛋白rEgferritin免疫小鼠產(chǎn)生的抗細粒棘球蚴感染的免疫機制。方法 rEgferritin免疫ICR小鼠3次、同時設立佐劑組和對照組，第12w用細粒棘球蚴原頭蚴對3組小鼠進行攻擊感染，5個月后剖殺小鼠，檢查各組小鼠腹腔內包囊個數(shù)，根據(jù)公式計算保護力。分別于0w，12w，32w取血，制備血清，同時取脾，制備淋巴細胞懸液。通過ELISA檢測血清中的IgG及其抗體亞型、IgE及MTT；通過流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD＋4及CD＋8亞群百分比。結果 rEgferritin組小鼠血清中的IgG，IgG2a，IgG2b持續(xù)增高，與佐劑組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；3組IgG3無差異。rEgferritin組免疫小鼠可誘導小鼠產(chǎn)生85.6%的保護力抵御細粒棘球蚴原頭蚴的再次感染，與對照組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；rEgferritin組和佐劑組CD＋4T細胞和CD＋8T細胞均增加，rEgferritin組CD＋4T細胞增加更為明顯，與佐劑組相比有顯著性差異（P＜0.01）。rEgferritin組脾細胞在受到rEgferritin抗原和天然抗原刺激后，細胞增殖明顯。結論 細粒棘球蚴重組抗原rEgferritin通過誘導宿主產(chǎn)生體液免疫級細胞免疫應答的方式抵御細粒棘球蚴感染的，說明rEgferritin是具有研究價值和潛力的包蟲病候選疫苗分子。

細粒棘球蚴；鐵蛋白；免疫應答

2.寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學與細胞生物學教研室；

3.寧夏回族自治區(qū)遺傳與生殖重點實驗室

細粒棘球蚴病又稱包蟲病，是一種人獸共患寄生蟲病。它是導致各國尤其是發(fā)展中國家［1］的致殘率和致死率較高的原因之一。許多國家已經(jīng)實施對細粒棘球蚴蟲終宿主病狗及其糞便的處理等防控措施，在一定程度上減少了細粒棘球蚴的蟲卵從狗向人的傳播，可是包蟲病在世界某些地區(qū)的發(fā)病率仍然高發(fā)甚至有回升趨勢［2］。近年來，用疫苗防控寄生蟲病成為研究的熱點。鐵蛋白作為寄生蟲疫苗的候選基因受到了越來越多的關注。曼氏血吸蟲［3］，日本血吸蟲［4－5］，牛帶絳蟲［6］，細粒棘球絳蟲［7］及細粒棘球蚴中國株的鐵蛋白基因已相繼被克隆［8］，本課題組前期已經(jīng)構建了細粒棘球蚴重組表達質粒Eg.ferritin/pET－28a，并純化出重組鐵蛋白［9］。本實驗在此基礎上，通過體內試驗，初步研究細粒棘球蚴鐵蛋白作為抗原免疫小鼠后進行細粒棘球蚴攻擊感染實驗，觀察小鼠的相關體液免疫和細胞免疫指標。

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雄性ICR小鼠，體重（18±2）g，共30只，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 細粒棘球蚴原頭蚴 從寧夏醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科包蟲病患者手術摘除的完整包囊中無菌條件下抽取囊液，分離原頭蚴，經(jīng)PBS（pH 7.2）洗滌3次后，棄去上清液，用0.5%伊紅染色計數(shù)原頭蚴的著色率及形態(tài)，原頭蚴的存活率＞90%，用PBS配成1.5×104個原頭蚴/mL懸液，用于攻擊感染ICR小鼠。

1.1.3 細粒棘球重組表達菌株Eg.ferritin/pET－28a/BL21plysS由本室提供。

1.1.4 主要試劑 辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2bIgG3、IgE及 ConA（刀豆蛋白A）、MTT購自華美生物工程公司北京分公司。RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBiCO公司產(chǎn)品；PE標記的大鼠抗小鼠CD＋8T以及FITC標記的大鼠抗小鼠CD＋3T細胞亞群單克隆抗體為BD Biosciences產(chǎn)品，購自北京利文商貿有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組免疫及攻擊感染 將ICR小鼠隨機分為A、B、C 3組，每組15只。A組為rEgferrtin免疫組；B組佐劑組；C組為對照組：不免疫攻擊感染組。A組：免疫注射50μg rEgferritin和等量弗氏佐劑的乳化劑，B組：注射與A組等量弗氏佐劑與PBS的乳化劑，第1次免疫為基礎免疫注射弗氏完全佐劑，以后2次為加強免疫，注射弗氏不完全佐劑。兩組小鼠在0、2、4w各免疫1次，共3次，均采用背部皮下多點注射免疫，每次注射量為100μL/只。12w時，A、B、C組小鼠各用1500枚/只活棘球蚴原頭蚴腹腔內注射進行攻擊感染。分別于免疫前（0w）攻擊感染 （12w）和剖殺（32w）小鼠眼眶采血，將血液4 000r/min離心10min，吸取血清，－85℃保存。

1.2.2 各組小鼠免疫保護力的計算 攻擊感染后20w（即32w）剖殺小鼠，打開小鼠腹腔，對各組小鼠腹腔內包囊個數(shù)進行計數(shù)并測量包囊直徑，根據(jù)公式計算出各組小鼠的保護力，免疫保護力（%）＝（1－實驗組平均包囊數(shù)/對照組平均包囊數(shù)）× 100%［10］。

1.2.3 ELISA檢測IgG及其亞型和IgE抗體 用終濃度為10μg/mL rEgferritin—碳酸緩沖液（pH 9.6）包被96孔酶標板，100μL/孔，4℃過夜；次日用PBS洗板3次，5%脫脂奶粉37℃封閉2h；加1∶100稀釋的A、B、C組鼠血清，100μL/孔，37℃反應2h，PBS洗板3次；加入1∶1 000稀釋的羊抗鼠Ig－HRP（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及IgE）100μL/孔，37℃反應2h，PBS洗板3次；加四甲基聯(lián)苯胺（TMB 40mg/mL）底物溶液，15min后用2mol/L H2SO4（50μL/孔）終止反應，用酶標分析儀測定OD490nm每孔的吸光值。

1.2.4 脾細胞懸液制備 剖殺A、B、C組小鼠，置75%乙醇中消毒3min；無菌取脾，勻漿，用2mL PBS沖洗，200目尼龍膜過濾，濾液置10mL離心管；加5～10倍的紅細胞裂解液來溶解紅細胞，離心5min，2 000r/min；去上清，用PBS洗2次，離心5min，2 000r/min；去上清，加2mL PBS，計數(shù)后用含10%BSA的RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×106/mL；臺盼藍染色后發(fā)現(xiàn)脾細胞存活率＞95%。

1.2.4.1 脾細胞CD＋4T、CD＋8T亞群測定 將上述制備好的脾細胞懸液5×106/mL，取200μL，每份標本分兩組，4℃離心去上清，先用含F(xiàn)ITC標記的CD＋3單抗進行標記，然后用PE標記的CD＋8標記，靜置30min后，再次離心，以2mL冷PBS緩沖液（含小牛血清及NaN3）洗2次，加入1%多聚甲醛0.5mL，4℃保存。流式細胞儀檢測脾CD＋4、CD＋8淋巴細胞亞群的百分比，用B－D流式細胞儀523nm波長下測定細胞熒光，每次測定1×105個細胞，分析軟件為Mod Fit LT。

1.2.4.2 T淋巴細胞增殖試驗（MTT法） 將A、B、C各組小鼠的脾細胞懸液5×106/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板，分別用培養(yǎng)液、ConA、重組抗原（rEgferritin）及天然抗原（原頭蚴勻漿后制備的上清）刺激后檢測T淋巴細胞活性，刺激物的工作濃度皆為5μg/mL，每份標本分無刺激、ConA、rEgferritin和天然抗原4小組，均重復3孔，置37℃5%CO2條件下培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結束前4h，加入20μL MTT（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，結束后2 000r/min，離心10min，棄100μL上清，加100μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩，輕輕反復吹打至甲簪（formazane）充分溶解，測定吸光度（OD490nm）。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行分析，組間比較用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結 果

2.1 各組血清中IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3及IgE的測定 鐵蛋白組IgG隨時間的延長一直上升，并且在攻擊感染后（12w）繼續(xù)上升，與佐劑和對照組相比有顯著差異，佐劑組IgG和對照組在攻擊感染后（12w）有所上升，見圖1。鐵蛋白組IgG1攻擊感染后明顯上升，與佐劑組和對照組有顯著差異，佐劑組隨時間無明顯變化，對照組IgG1在剖殺前（32w）與攻擊前（12w）和免疫前（0w）相比有所下降，與佐劑組相比有差異，見圖2。鐵蛋白組IgG2a隨時間的延長不斷增加，與佐劑組和對照組相比有顯著差異，佐劑組與對照組之間無明顯差異，見圖3。鐵蛋白組IgG2b隨免疫次數(shù)的增加而增加，與佐劑組及對照組相比有顯著性差異。佐劑組IgG2b12w稍微增高，之后下降為正常，與對照組之間無差異，見圖4。鐵蛋白組、佐劑組和對照組IgG3均隨時間下降，至在12w達到最低，之后上升為免疫前水平，3組之間相比無統(tǒng)計學差異，見圖5。鐵蛋白組及佐劑組的IgE值持續(xù)上升，2組之間無差異，與對照組相比有顯著差異，而對照組在12w后有所上升，見圖6。

圖1 IgG的變化Fig.1 Variation of IgG

圖6 IgE的變化Fig.6 Variation of IgE

2.2 免疫保護力的測定 3組小鼠腹腔內注射細粒棘球蚴原頭蚴1500枚/只，除對照組1只小鼠攻擊感染后死亡，其余3組小鼠，5個月后（32w）剖殺，檢查小鼠腹腔內各個器官，計數(shù)包囊個數(shù)及直徑。發(fā)現(xiàn)鐵蛋白免疫組小鼠體內的包囊數(shù)及包囊大小與佐劑組和對照組相比明顯少，并具有顯著性差異（P＜0.01）。根據(jù)公式計算出相對于對照組，鐵蛋白可誘導小鼠產(chǎn)生85.6%的免疫保護力抵御攻擊感染，佐劑組可產(chǎn)生56.3%，見表1。

2.3 脾細胞中CD＋4T及CD＋8T細胞亞群的測定原頭蚴攻擊感染后20周，鐵蛋白組的脾淋巴細胞CD＋4T和CD＋8T均有增高，CD＋4T與佐劑組和對照組相比明顯增加，有顯著性差異（P＜0.01），CD＋8T與佐劑組的之間差異顯著（P＜0.05），與對照組相比無明顯差異。佐劑組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表1 各組小鼠產(chǎn)生的包囊數(shù)及免疫保護力Table 1 Number of hydatid cysts and protective immunity in three groups

表2 原頭蚴攻擊感染后各組小鼠脾淋巴細胞亞群的檢測Table 2 Detection on subsets of spenocytes of three group mice after challenged with Egprotoscoleces

2.4 各組脾細胞增殖實驗rEgferritin抗原 3組小鼠脾淋巴細胞與四種物質共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用ConA刺激可使3組脾淋巴細胞增殖能力均提高，與同組無刺激物相比具有統(tǒng)計學差異，但3組之間無統(tǒng)計學差異（圖7）。用rEgferritin抗原刺激后，鐵蛋白組脾淋巴細胞與其它兩組相比明顯增加（P＜0.05），與同組無刺激物和conA刺激相比具有顯著性差異，佐劑組與對照組之間無明顯差異。用天然抗原原頭蚴刺激后，鐵蛋白組脾淋巴細胞增加更為明顯與其它兩組相比具有顯著性差異（P＜0.01），與同組無刺激物和conA刺激相比具有顯著性差異，佐劑組與對照組之間無明顯差異。提示鐵蛋白組的脾淋巴細胞在體外能被rEgferritin蛋白誘導產(chǎn)生較好的免疫記憶能力，被特異性的刺激增生。

圖7 3組小鼠淋巴細胞的增殖Fig.7 Three groups of lymphocytes cell growth with different stimulation

3 討 論

本實驗室前期工作已經(jīng)顯示，細粒棘球蚴重組鐵蛋白具有較好的抗原性及免疫原性，誘導小鼠可產(chǎn)生較高的免疫能力抵抗細粒棘球蚴原頭蚴的感染。但是對于重組鐵蛋白誘導小鼠產(chǎn)生怎樣的免疫機制抵抗感染目前未見相關報道。本次實驗重組鐵蛋白誘導小鼠產(chǎn)生的免疫機制進行初步研究。

目前一些研究表明在抵抗細粒棘球蚴感染中體液免疫和細胞免疫均發(fā)揮重要的作用［11－12］。在2次Eg感染小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，感染前3d內，腹腔注射的PSC周圍很快被細胞浸潤。早期血清中可檢測到微量的IgG1，IgG2a和IgG3。后期血清中的IgG1，IgG2a和IgG3達到高水平［13］。感染腸道寄生蟲的宿主血清中通常都能檢測到高水平的IgE［14－15］。IgE依賴肥大細胞，聚集嗜酸性粒細胞至寄生蟲周圍，增強嗜酸性粒細胞抗寄生蟲的功能。本實驗關于小鼠血清IgG及其亞型和IgE的檢測顯示：鐵蛋白組IgG在免疫后及攻擊感染后持續(xù)增加，佐劑組在攻擊感染后IgG增加這與我們前期實驗［9］和Liu［16］等觀察的細粒棘球蚴感染小鼠的結果相似。鐵蛋白組IgG1在攻擊感染后增加明顯，而對照組IgG1在攻擊感染后下降，這提示鐵蛋白誘導小鼠產(chǎn)生高的IgG1具有抵抗細粒棘球蚴生長的作用，對照組IgG1下降，有利于寄生蟲的生長。鐵蛋白組IgG2a，IgG2b在免疫后和攻擊感染后持續(xù)增加，與佐劑組和對照組相比均具有顯著性差異，說明IgG1，IgG2a，IgG2b在抗寄生蟲感染中發(fā)揮著重要的作用。3組IgG3變化一致，無明顯變化，IgG3參與免疫逃逸機制。鐵蛋白組及佐劑組的IgE值持續(xù)上升，兩組之間無統(tǒng)計學差異，與對照組相比有顯著性差異，而對照組在12w后有所上升，這些可能與IgE參與致敏反應有關。

淋巴細胞包括兩個主要亞群：CD＋4＋和CD＋8T細胞，在寄生蟲感染中，兩種細胞都可參與宿主保護力和病理變化的形式。Riley等［17］發(fā)現(xiàn)感染Eg原頭蚴的小鼠淋巴結CD＋4T細胞亞群降低，CD＋8T細胞亞群升高。本研究中rEgferritin蛋白免疫小鼠，原頭蚴攻擊感染后20周CD＋4T細胞與佐劑組和對照組相比顯著增高（P＜0.01），CD8＋T細胞與佐劑組相比顯著升高（P＜0.05），但佐劑組和對照組相比較無顯著性差異（P＞0.05）。推測該重組抗原刺激CD＋4T細胞可能向Th1細胞分泌，介導細胞免疫應答，還可能激活巨噬細胞和NK細胞，增加它們殺傷細粒棘球蚴的作用。同時CD＋8T的殺傷性T細胞也被抗原激活，形成細胞毒性T（Tc）淋巴細胞，可能通過細胞裂解和細胞凋亡殺傷細粒棘球蚴。佐劑組的小鼠在佐劑的刺激下產(chǎn)生了一定的非特異性的抗體，可在感染早期，刺激機體產(chǎn)生高的CD＋4T殺傷細粒棘球蚴，形成保護性免疫，細粒棘球蚴增長緩慢，感染后期以CD＋4T下降，使得細粒棘球蚴出現(xiàn)明顯增殖，宿主體內感染嚴重。這與Sakamoto等［18］報道基本一致。

淋巴細胞增殖實驗是反映細胞免疫應答的傳統(tǒng)方法之一，MTT法檢測證實rEgferritin免疫組的小鼠脾淋巴細胞，用rEgferritin和天然抗原刺激培養(yǎng)后，脾淋巴細胞的數(shù)目遠高于原液和conA刺激的值，具有顯著差異（P＜0.05）。推測rEgferritin可誘導小鼠脾細胞產(chǎn)生較好的記憶能力。而且用天然抗原刺激與rEgferritin刺激相比也有顯著差異（P＜0.05）?？紤]由于rEgferritin是包涵體，在純化的過程中，蛋白的天然構象發(fā)生了一些改變。所以天然抗原比重組抗原更容易刺激細胞的增殖。

綜上所述，寄生蟲感染的免疫機制十分復雜，其中包括多種免疫細胞和細胞因子的參與，它們互相作用，互相制約形成調節(jié)網(wǎng)絡。研究寄生蟲感染的免疫機制及各類淋巴細胞的作用有助于制定有效的防治措施，對研制寄生蟲病疫苗更具有重要意義。但由于寄生蟲抗原的復雜性及免疫系統(tǒng)調節(jié)的精密性，各類淋巴細胞在各種寄生蟲感染中的免疫作用及其相互間的調節(jié)機制還不清楚，尚需進一步研究。通過本實驗初步證明rEgferritin可誘導小鼠產(chǎn)生85.6%的免疫保護力，通過體液免疫及細胞免疫應答方式抵御細粒棘球蚴感染的，是具有研究價值和潛力的包蟲病候選疫苗分子。下一步將對其免疫機制進行詳細研究，為寄生蟲免疫防御提供一定的理論依據(jù)。

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An initial investigation on effects of rEgferritin on immune response of mice infected with hydatid cysts ofEchinococcusgranulosus

WANG Ya－na，WANG Jie，WANG Shu－jing，ZHANG Yan，ZHAO Wei

（CenterofScientificTechnologyofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China）

In order to initially investigate the effects of rEgferritin on the immune response of mice infected with hydatid cysts ofEchinococcusgranulosus，ICR mice were immunized with rEgferritin by thrice and challenged by protoscoleces ofE.granulosusat 12week.Mice were killed at 20weeks after infection，and blood of mice were obtain at 0week，12week and 32 week prepare serum，The splenocytes were isolated and the percentages of the splenic CD＋4and CD＋8T lymphocytes were measured by FCM .In every groups splenocytes were cultivated with stimulation of rEgferritin native antigen，ConA and normal nutrient.The levels of the supernatant of cultures were determined by ELISA.The adjuvant group and blank group were set up for comparison.It was found that the OD values of IgG，IgG2aand IgG2bof immunized group were all higher than that of the control group（P＜0.01），and the OD value of IgG3was no significant difference among the three groups.Mice vaccinated with rEgferritin and challenged intraperitoneally withE.granulosusprotoscoleces revealed significant protective efficacy up to 85.6%.The percentage of the splenic CD＋4and CD＋8T lymphocytes were all increased in the immunized group of mice，but CD＋4T lymphocytes of immunized group were obviously higher than adjuvant group and control group（P＜0.01），splenic lymphocytes cell of immunized rEgferritin group of mice were growthed obviously by induced with rEgferritin protein and native antigen ofEchinococcusgranulosus.These data indicated that rEgferritin protein immunized could can induce humoral immunity of mice against the hydatid cyst ofE.granulosus.The rEgferritin might be a valuable candidate vaccine for against hydatid disease.

Echinococcusgranulosus；rEgferritin；immune response

R383.3

A

1002－2694（2011）10－0882－05

＊國家自然科學基金（30660167），寧夏回族自治區(qū)自然科學基金（NZ0993）

趙巍，Email：zw－6915＠163.com

1.寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學科學技術研究中心，銀川 750004；

2011－05－04；

2011－07－30