蔣國華,廖維甲,覃理靈,梅銘惠,陳 謙,袁晟光,劉 杰

(1.桂林市衛(wèi)生學(xué)校,廣西桂林 541002;2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001）

AFP診斷HCC是目前公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物,但陽性率僅為70%左右,假陰性率達(dá)30%,且AFP水平高低與腫瘤大小有關(guān),不利于HCC的早期診斷和小肝癌的發(fā)現(xiàn),尤其是術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測。HCC根治切除術(shù)后3年和5年的復(fù)發(fā)率分別高達(dá)50%和70%[1],需要尋找更加敏感的早期診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測指標(biāo)。近年發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC-3）與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),它是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白,基因位于人染色體X26.10,由8個外顯子組成,啟動子區(qū)有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[2],國內(nèi)學(xué)者對GPC3研究不多,國外學(xué)者對GPC-3在HCC的發(fā)生和發(fā)展提出了一些假說。本文采用RT-PCR方法對HCC癌組織及癌旁組織測定GPC-3 mRNA的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本60例HCC癌組織及其癌旁組織取自本院肝膽外科HCC手術(shù)切除的肝臟組織。男52例,女性8例,平均年齡49歲;腫瘤直徑＜5 cm 13例,5 cm＜腫瘤直徑＜10 cm 28例,＞10 cm或伴有肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移19例;腫瘤數(shù)目單個47例,2個或2個以上13例;腫瘤有完整包膜24例,無包膜或包膜不完整36例;11例有鏡下門靜脈癌栓,血清AFP陽性41例,HBsAg陽性56例。所有的組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實。60例癌旁組織病理診斷:18例慢性肝炎,36例肝硬化,6例正常組織。標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后立即分裝放入液氮保存。

1.2 試劑和儀器RNA提取試劑盒Trizol(Invitrogn公司）,maker、RT-PCR試劑盒(寶生物工程(大連）有限公司）,紫外分光光度計和RT-PCR儀(BIO公司）。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank的相應(yīng)cDNA序列,運用Premier 5.0軟件設(shè)計GPC-3和β-Actin引物序列,并經(jīng)Pubmed Blast對比分析,均具有較好的特異性,由上海生物工程公司合成。設(shè)計GPC-3上游引物序列為:5′-CCAACATGCTGCTCAAGAAAGATGGAAG-3′,下游引物序列為 :5′-CAAACTCAAAAGCTTGTGGAGTCAGGCT-3′,擴增片段長度為 226 bp;內(nèi)對照基因β-Actin的上游引物序列為:5′-TCAC2CCACA CTGTGCCCATCTACGA-3′,下 游 引 物 序 列 為 :5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′,擴增片斷 長度為400 bp。

1.4 方法取HCC組織、癌旁組織約50 mg制成勻漿,加入1 ml TRIzol,冰浴。吸1 ml勻漿液至離心管中,4℃離心 12 000 r/min×10 min。取上清0.8 ml,加入0.2 ml氯仿,震蕩2 min,4℃離心10 000 r/min×10 min,取上清0.3 ml,加100%異丙醇0.3 ml,再加50%異丙醇0.5 ml,震蕩30 s,4℃離心12 000 r/min×5 min,棄上清,加1 ml 750 ml/L乙醇,輕輕洗滌沉淀,4℃離心12 000 r/min×5 min,棄上清,室溫靜置3 min,將乙醇晾干,加20 μ l 0.1%氯化鋰溶解沉淀。抽提的 RNA質(zhì)量鑒定:紫外分光光度計定260/280比值(比值均在1.7-2.0）;并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解,所用RNA均無降解。為了去除基因組DNA的污染,全部RNA均用無RNA酶的DNA酶Ⅰ消化后,置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,進(jìn)行PCR擴增,PCR反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退 30 s,72℃延伸 40 s,共 35循環(huán)(βactin為28循環(huán)）。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳,經(jīng)灰度掃描,凝膠圖像分析儀分析,以GPC-3和βactin的比值作為GPC-3 mRNA的相對含量。對病人的臨床病理學(xué)資料進(jìn)行分析,研究HCC病人的GPC-3 mRNA陽性和陰性表達(dá)與其性別、年齡、腫瘤的大小 、腫瘤數(shù)目 、AFP 、HBsAg、有無包膜 、轉(zhuǎn)移 、門靜脈癌栓各指標(biāo)間的關(guān)系;探討GPC-3 mRNA表達(dá)水平與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性,在筆者課題組的一項研究中,曾將肝癌術(shù)后3年內(nèi)不復(fù)發(fā)患者設(shè)定為預(yù)后良好組,反之亦然[3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗和卡方檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPC-3 mRNA在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果表明,60例HCC標(biāo)本中,HCC癌組織中GPC-3 mRNA表達(dá)陽性的有41例,陽性率68.3%,癌旁組織中GPC-3 mRNA低表達(dá)或不表達(dá)。其中24對HCC的PCR產(chǎn)物電泳圖如下圖1。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳圖,經(jīng)灰度掃描,系統(tǒng)軟件分析,HCC組織、癌旁組織的GPC-3與β-actin比值的相對含量分別為:0.53±0.13,0.23±0.05,其差異有顯著性,見表1。

圖1 基因GPC-3在HCC癌組織高表達(dá)(RT-PCR）

表1 基因GPC-3在HCC癌組織及癌旁組織表達(dá)水平的比較

2.2 統(tǒng)計學(xué)分析GPC-3mRNA陽性和陰性表達(dá)與其腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、有無包膜、門靜脈癌栓、HB-sAg及AFP水平各指標(biāo)間均無明顯差異(P＞0.05）;而與HCC術(shù)后3年內(nèi)是不是復(fù)發(fā)有直接關(guān)系,在60例HCC標(biāo)本中,有18例3年內(nèi)不復(fù)發(fā),其中GPC-3 mRNA表達(dá)陰性為15/18(83.3%）,表達(dá)陽性為3/18(16.7%）,兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。

3 討論

目前國內(nèi)學(xué)者對GPC-3研究甚少,國外研究表明,GPC-3在肝癌組織中mRNA呈高表達(dá)[4],而在成人正常組織、HCC癌旁組織、肝炎、肝硬化組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)[5,6];本研究證實這一點,實驗結(jié)果表明,GPC-3 mRNA在HCC癌組織中高表達(dá),陽性率68.3%,而在癌旁組織中為低表達(dá)或不表達(dá),GPC-3在HCC組織中有穩(wěn)定的表達(dá),提示其在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,這種選擇性表達(dá)特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點。也可能是一種新的HCC的癌胚抗原。因此,近年來倍受關(guān)注,被學(xué)者稱之為HCC新的特異性標(biāo)志物及潛在分子治療的靶點[7,8],GPC-3能顯著提高小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)的鑒別診斷[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)GPC-3 mRNA的表達(dá)與其腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、有無包膜、門靜脈癌栓、HBsAg及AFP水平各指標(biāo)間均無明顯差異(P＞0.05）,提示檢測HCC組織中的GPC-3基因的表達(dá)對于預(yù)測腫瘤的惡性程度、病情輕重?zé)o明顯價值。尤其是GPC-3 mRNA的表達(dá)高低與血清AFP水平無明顯差異,在血清AFP陰性的原發(fā)性肝癌中仍有一定的陽性率,提示對血清AFP陰性的肝癌診斷具有一定的輔助意義,有望作為比AFP更加理想的肝細(xì)胞癌早期診斷的敏感標(biāo)記物。但也有學(xué)者指出:GPC3是一個細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)[9],其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、信號通路等方面的研究也得到了廣泛關(guān)注。

目前外科切除仍然是HCC最主要和有效的治療方法,但絕大多數(shù)HCC患者發(fā)現(xiàn)時較晚,不一定有手術(shù)機會;另外,根治性切除術(shù)后的高復(fù)發(fā)率已成為提高肝癌生存率的一個瓶頸,也是攻克肝癌最重要的難關(guān)之一。因此,早期預(yù)測、診斷肝癌的復(fù)發(fā),并采取有效措施進(jìn)行干預(yù)是進(jìn)一步提高肝癌外科療效的關(guān)鍵。GPC-3 mRNA表達(dá)與HCC術(shù)后3年內(nèi)是不是復(fù)發(fā)有直接關(guān)系,術(shù)后3年內(nèi)不復(fù)發(fā)HCC患者的癌組織中GPC-3 mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)水平,而在術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)HCC患者癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)水平。本研究雖然采用的病例數(shù)有限,但它卻提示了:GPC-3 mRNA高表達(dá)水平極大地增加了HCC患者術(shù)年復(fù)發(fā)風(fēng)險,也說明GPC-3可能是判斷HCC預(yù)后重要指標(biāo);同時可以設(shè)想,通過外界因素,如小分子的GPC-3靶向藥物、siRNA干擾等人工沉默敲除GPC-3基因,以達(dá)到降低HCC患者肝癌組織中GPC-3表達(dá)水平的目的,從而減少HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。迄今為止,人們對GPC-3的了解,尤其是在HCC中的了解十分有限,它的諸多功能、作用機制以及與相關(guān)基因的相互關(guān)系等許多方面還不十分清楚,有待于進(jìn)一步深入研究。

[1]Llovet JM,Bu rroughs A,Bru ix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2003,362(9399）:1907.

[2]Baumhoer D,Tornillo L,Stadlmann S,et al.Glypican 3 expression in human nonneoplastic,preneoplastic,and neoplastic tissues:a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples[J].Am J Clin Pathol,2008,129:899.

[3]Xie XW,Mei MH,Liao WJ,et al.Expression of CIITA-related MHCII molecules in tumors linked to prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol.2009Mar;34(3）:681.

[4]Lai JP,Oseini AM,Moser CD,et al.The oncogenic effect of sulfatase 2 in human hepatocellular carcinoma is mediated in part by glypican 3-dependent Wnt activation[J].Hepatology,2010,52(5）:1680.

[5]Yam auchi N,Watanabe A,H ishinuma M,et al.The glypican 3 oncofetal protein is a promising diagnostic markerfor hepatocellular carcinoma[J].Mod Pathol,2005,18(12）:1591.

[6]Saito Y,Oba N,Nishinakagawa S,et al.Identification of beta2-microgloblin as a candidate for early diagnosis of imaging-invisible hepatocellular carcinoma in patient with liver cirrhosis[J].Oncol Rep,2010,23(5）:1325.

[7]Suzuki M,Sugimoto K,Tanaka J,et al.Up-regulation of glypican-3 in human hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,2010,30(12）:5055.

[8]DiTommaso L,Franchi G,Park YN,et al.Diagnostic value of HSP70,glypican 3,and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis[J].Hepatology,2007,45(3）:725.

[9]Liu B,Bell AW,Paranjpe S,et al.Suppression of liver regeneration and hepatocyte proliferation in hepatocyte-targeted glypican 3 transgenic mice[J].Hepatology,2010,52(3）:1060.