胡偉鑫 陳春美 石松生 楊衛(wèi)忠 李紹熹 葉金練

1)福建安溪銘選醫(yī)院神經(jīng)外科 安溪 362400 2)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科 福州 350001

實(shí)體瘤生長(zhǎng)到一定程度時(shí),腫瘤細(xì)胞增殖的速度超過(guò)腫瘤血管生成的速度。細(xì)胞對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境為低氧分壓、低糖和酸性。這種情況激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF(主要是 HIF-1α),從而誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)糖酵解,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的微環(huán)境[1]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)廣泛參與了膠質(zhì)瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過(guò)程,與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化檢測(cè)低度和高度惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本,分析iNOS、HIF-1α和VEGF在膠質(zhì)瘤中表達(dá)特點(diǎn)及其相關(guān)性,為后期膠質(zhì)瘤靶基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 羊抗人的iNOS、HIF-1α和VEGF單克隆一抗體、SP法免疫組化超敏試劑盒和DAB染色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究對(duì)象 收集協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科2005-06～2008-01手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本86例,男54例,女32例,年齡最小12歲,最大73歲,平均45.4歲。所有病例均為手術(shù)后病理學(xué)切片證實(shí)為膠質(zhì)瘤,且均為第一次手術(shù),術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。按照2000年WHO腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)(低度惡性膠質(zhì)瘤,低度惡性組)42例,Ⅲ～Ⅳ(高度惡性膠質(zhì)瘤,高度惡性組)級(jí)44例。其中低度惡性組42例包括星形細(xì)胞瘤Ⅰ、Ⅱ級(jí)27例,少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例,室管膜下瘤5例,少突-星形細(xì)胞瘤 3例;高度惡性組42例,包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤16例,間變性星形細(xì)胞瘤11例,間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例,間變性少突-星形細(xì)胞瘤7例。另取腦外傷病人行內(nèi)減壓手術(shù)而取得的新鮮腦組織10例(正常腦組織組)作為對(duì)照組。

1.3 免疫組織化學(xué)(SP法)檢測(cè)iNOS、HIF-1α和 VEGF在不同組標(biāo)本中表達(dá) 取膠質(zhì)瘤和腦外傷正常腦組織各一份,10%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,3.0μm厚連續(xù)切片,石蠟切片脫蠟至水,抗原修復(fù),加50μL內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷液(A液)孵育,漂洗,加 50μL非免疫動(dòng)物血清(B液)孵育,分別加入50μL的羊抗人 iNOS、HIF-1α和 VEGF一抗,置濕盒4℃孵育過(guò)夜,PBS沖洗,加生物素標(biāo)記二抗50μL(C液)孵育,鏈霉素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合體溶液孵育,DAB呈色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,常規(guī)梯度酒精脫水之后封片,中性樹(shù)膠封片,取正常腦組織對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選用兩樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析、線性回歸分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α抗原在對(duì)照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達(dá)特點(diǎn) HIF-1α抗原的表達(dá)定位于部分正常腦組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞核上,為黃色或棕黃色顆粒,在腫瘤浸潤(rùn)邊緣表達(dá)明顯。對(duì)照組正常腦組織細(xì)胞核中不表達(dá)或低表達(dá);低度惡性組呈陽(yáng)性表達(dá),而高度惡性組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),HIF-1α抗原在3組之間表達(dá)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表 1、圖 1。

2.2 iNOS抗原在對(duì)照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達(dá)特點(diǎn) iNOS抗原的表達(dá)定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞漿,為黃色或棕黃色顆粒。對(duì)照組正常腦組織中不表達(dá);低度惡性組呈陽(yáng)性表達(dá),而高度惡性組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),iNOS抗原在2組之間表達(dá)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表1、圖1。

2.3 VEGF抗原在對(duì)照組、低度惡性組和高度惡性組中的表達(dá)特點(diǎn) VEGF抗原的表達(dá)定位在正常腦組織組和膠質(zhì)瘤組細(xì)胞均有表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá),呈棕黃色或棕褐色顆粒,其中正常腦組織弱陽(yáng)性表達(dá),低度惡性組呈陽(yáng)性表達(dá),而高度惡性呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),3組之間表達(dá)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表1、圖1。

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對(duì)照組和膠質(zhì)瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

表1 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在對(duì)照組和膠質(zhì)瘤組中的累積光密度(IOD) (±s)

注：與對(duì)照組比較,#P＜0.05;與低度惡性組比較,*P＜0.05

組別 n HIF-1α iNOS VEGF對(duì)照組 10 71.09±15.74 066.23±8.11低度惡性組 42 196.83±35.52 137.56±8.04#266.26±19.63#高度惡性組 44 348.20±37.16 429.75±62.19#*395.80±70.82#*

圖4 iNOS和VEGF抗原在膠質(zhì)瘤中線性回歸

2.4 HIF-1α、iNOS和 VEGF抗原在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性分析 根據(jù)免疫組化結(jié)果進(jìn)行各種抗原表達(dá)相關(guān)性分析,在膠質(zhì)瘤組中,HIF-1α和 iNOS、HIF-1α和 VEGF、iNOS和VEGF均存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.925、0.740、0.852,P值均＜0.05)。見(jiàn)圖2～4。

3 討論

iNOS在缺血、缺氧、腫瘤、損傷時(shí)高表達(dá),它可以催化底物L(fēng)-精氨酸的胍基氮產(chǎn)生NO,發(fā)揮復(fù)雜的病理生理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn),iNOS及其產(chǎn)物NO廣泛參與了腫瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過(guò)程,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤在缺氧甚至有氧狀態(tài)下增加糖酵解酶活性而加速糖酵解來(lái)獲取能量,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)發(fā)揮重要的作用,在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、治療等方面都有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在促進(jìn)腫瘤血管形成和生長(zhǎng)中起著重要作用,主要有[3-4]：(1)增加血管通透性：為腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供合適的基礎(chǔ);(2)促進(jìn)血管生成;(3)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制凋亡、抑制腫瘤免疫等。目前iNOS、HIF-1α和VEGF三者在膠質(zhì)瘤的表達(dá)特點(diǎn)的相關(guān)性還不明確。

目前研究認(rèn)為,在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中,iNOS、NO、VEGF相互作用促進(jìn)腫瘤性血管的生成,其中以VEGF的作用更為直接,同時(shí),VEGF受到 iNOS、NO的嚴(yán)密調(diào)控[5-6]。iNOS不僅通過(guò)產(chǎn)物NO和VEGF相互作用發(fā)揮其促血管生成作用,iNOS還可以與VEGF受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)血流量,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Papapetropoulos等學(xué)者認(rèn)為,iNOS、HIF-1α在腫瘤血管形成相互關(guān)系可能機(jī)制：HIF-1α蛋白穩(wěn)定性增加,不容易降解,上調(diào)iNOS表達(dá),進(jìn)而上調(diào)NO,NO是一種重要的炎癥介質(zhì),能促進(jìn)VEGF與其受體結(jié)合,促使內(nèi)皮細(xì)胞拉長(zhǎng)、伸展,發(fā)生有絲分裂、移行和血管的進(jìn)一步形成[7]。

本實(shí)驗(yàn)中 iNOS在正常腦組織沒(méi)有表達(dá),HIF-1α和VEGF抗原在正常腦組織低表達(dá),三種蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá),而且高度惡性組表達(dá)均明顯強(qiáng)于低度惡性組,惡性度越高,表達(dá)量越多,說(shuō)明 iNOS、HIF-1α和 VEGF三種基因與膠質(zhì)瘤惡性度相關(guān),參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。采用SPSS軟件分析結(jié)果顯示,iNOS、HIF-1α和VEGF三種基因在正常腦組織組、低度惡性組和高度惡性組關(guān)系存在兩兩正相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步證實(shí) HIF-1α、iNOS和 VEGF等三種基因共同參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,HIF-1α和iNOS相互協(xié)調(diào),HIF-1α和iNOS二者在膠質(zhì)瘤發(fā)展過(guò)程中存在相互促進(jìn)作用,其機(jī)制可能為在腫瘤缺氧條件下HIF-1α表達(dá)水平增高,誘導(dǎo)iNOS表達(dá),而iNOS催化精氨酸產(chǎn)生的NO,后者則誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá),形成正反饋環(huán),促進(jìn)膠質(zhì)瘤異常增殖;HIF-1α和iNOS共同促進(jìn)調(diào)控VEGF表達(dá),后者是直接促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管形成和生長(zhǎng)中最為關(guān)鍵的因子,三者相互協(xié)調(diào),共同促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

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