王慧珊 ，高志強(qiáng) ，王金寶 ，張鶴曉 ，喬彩霞 ，吳亞瓊 ，邢佑尚 ，朱淑芬

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島，266109；2. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 通州，101113；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南，250100；4. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安，271018）

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種高度接觸傳染性腸道疾病，臨床上以病豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和失水為主要特征，不同品種、年齡的豬只都可感染發(fā)病，尤以兩周齡以內(nèi)仔豬、斷奶仔豬易感性最強(qiáng)，致死率高，可達(dá)100%[1]。該病是一種世界性疾病，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，早發(fā)現(xiàn)、早確診對(duì)該病的防治意義重大。要做到早確診就需要快速、敏感、特異的診斷方法。

目前，檢測(cè)TGEV的常規(guī)方法主要有病毒分離鑒定、病毒中和試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、電鏡觀察、免疫電鏡觀察、ELISA方法[2]、核酸探針雜交技術(shù)[3]、普通RT-PCR技術(shù)[4]、多重RT-PCR技術(shù)等。這些方法在過(guò)去對(duì)豬傳染性胃腸炎的防制和診斷上起到了重要的作用，但是這些技術(shù)要么操作繁瑣，周期長(zhǎng)，要么靈敏性差，只能進(jìn)行定性檢測(cè)而不能定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性、高精確定量和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于病毒感染的檢測(cè)，尤其是感染早期檢測(cè)。為此我們建立了針對(duì)TGEV的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為T(mén)GEV感染的早期診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡(jiǎn)便、快速、高效、敏感、特異的方法。

豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）和TGEV在結(jié)構(gòu)上非常相似，同源性達(dá)96%以上，被認(rèn)為是TGEV的自然突變株[5]。在基因結(jié)構(gòu)上，相比TGEV，PRCV只是S基因缺失了B、C兩個(gè)抗原位點(diǎn)，只針對(duì)保守基因N基因建立檢測(cè)方法可能會(huì)對(duì)PRCV造成錯(cuò)檢。因此，本研究除針對(duì)保守基因設(shè)計(jì)引物探針，同時(shí)針對(duì)PRCV S基因的缺失位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物探針來(lái)進(jìn)一步區(qū)分PRCV和TGEV。

1 材料與方法

1.1 病毒株

滅活的豬傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)urdue P115、藍(lán)耳病病毒核酸、豬偽狂犬病毒核酸、豬呼吸道冠狀病毒核酸，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬鏈球菌2型分離株C55606核酸，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶， dNTP、RNA酶抑制劑等購(gòu)自Promega公司。

主要儀器有臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5417R）；熒光定量 PCR儀（Roche Light CyclerⅡ）。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì)和合成

從GenBank登錄的TGEV分離株獲得不同基因型代表毒株的序列，利用DNAMAN基因分析軟件對(duì)其進(jìn)行同源性分析，選擇序列中高度保守的區(qū)域作為熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的區(qū)域，利用Oligo6.3軟件設(shè)計(jì)引物和探針。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)保守基因N基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物與Taqman探針，目的片段大小為144bp，同時(shí)針對(duì)S基因的B、C位點(diǎn)設(shè)計(jì)另一對(duì)引物與探針來(lái)區(qū)分TGEV與PRCV，目的片段為125 bp。

P1（N）： CTGAAAGGTGGTTCTTCTAC

P2（N ： CATTATTAGCACCACGACTA

Probe（N）：5'FAM-CCTTGGCAACCCAGACAA CTCC-TAMRA 3'

P1（S）：TCTGCTGAAGGTGCTATTAT

P2（S）：GAAGGACATATAGGGAACTTAT

Probe（S）：5'FAM-CACTCACTACCCCAATTGC AAGTC-TAMRA 3’

引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取

按照Trizol（Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)從TGEV細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA。

1.5 熒光RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1 引物和探針濃度的優(yōu)化

將引物濃度從 0.1 μM 至 0.8 μM 以 0.1 μM 間隔遞增，探針濃度從 0.025 μM 至 0.2 μM 以 0.025 μM 遞增。對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行比較。

1.5.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

應(yīng)用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度從1.5 mM至6.0 mM以0.5 mM間隔遞增。對(duì)不同Mg2+濃度條件下的擴(kuò)增進(jìn)行比較。

1.5.3 其它條件的優(yōu)化

應(yīng)用篩選好的引物探針和Mg2+的濃度，進(jìn)一步對(duì)Taq DNA聚合酶用量，多種逆轉(zhuǎn)錄酶，循環(huán)參數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

將 提 取 的 RNA（8.97lgTCID50/0.01mL）作101~1010倍稀釋?zhuān)M(jìn)行TGEV熒光RT-PCR檢測(cè)，測(cè)定檢測(cè)極限。同時(shí)用常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的靈敏性差異。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)不同稀釋度TCID50病毒RNA按最佳條件進(jìn)行熒光RT-PCR測(cè)定，并用去離子水作為陰性標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所獲得的Ct值作為定量參數(shù)對(duì)不同稀釋度的對(duì)數(shù)值做線性回歸。

1.8 特異性試驗(yàn)

利用本實(shí)驗(yàn)所建立的定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬呼吸道冠狀病毒和豬鏈球菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)3個(gè)不同濃度TCID50病毒核酸用所建立的檢測(cè)方法分別檢測(cè)3次，根據(jù)其Ct值求出變異系數(shù)，以驗(yàn)證方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床送檢樣品的檢測(cè)

對(duì)山東、遼寧等地3個(gè)豬場(chǎng)送檢的39份糞便樣品進(jìn)行處理，提取RNA，應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)。同時(shí)用常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果和流行狀況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化，建立反應(yīng)體系：5×RTPCR buffer 5 μL，引 物 P1（N，10 μM）0.5 μL，引 物P2（N，10 μM）0.5 μL，探針 Probe（N， 10 μM）0.3 μL，dNTP（2.5 μM）2μL，M-MLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 0.5 μL，RNA 酶抑制劑 0.25 μL，Taq酶 0.25 μL，RNA 模板10 μL，補(bǔ)水至 25 μL。對(duì)于進(jìn)一步鑒別 TGEV 與 PRCV的檢測(cè)方法，建立反應(yīng)體系：5×RT-PCR buffer 5 μL，引物 P1（S，10 μM），引物 P2（S，10 μM）各 0.75 μL，探 針 Probe（S，10 μM）0.4 μL，dNTP（2.5 μM）2 μL，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，RNA 酶抑制劑 0.25 μL，Taq 酶 0.25 μL，RNA 模板 10 μL，補(bǔ)水至 25 μL。

2.2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化

從多次重復(fù)性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方法最適循環(huán)參數(shù)為 42℃ /30 min，94℃ /3 min;94℃ /10 s，55℃/10 s，60℃/30 s;45個(gè)循環(huán)，60 ℃時(shí)收集熒光。

鑒別TGEV與PRCV的檢測(cè)方法最適循環(huán)參數(shù)為 42℃ /30 min，94℃ /3 min;94℃ /10 s，54℃ /10 s，60℃/30 s;45個(gè)循環(huán)，60℃時(shí)收集熒光。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

將病毒RNA進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑑蓚€(gè)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法結(jié)果顯示檢測(cè)極限均可達(dá)0.61TCID50。圖1為傳染性胃腸炎病毒的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。圖2為鑒別TGEV與PRCV的檢測(cè)方法的靈敏度結(jié)果。而普通RT-PCR檢測(cè)結(jié)果通過(guò)2.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，前三個(gè)稀釋度為陽(yáng)性，即檢測(cè)極限為61TCID50，（圖3）。由此可見(jiàn)熒光定量RT-PCR方法比普通RT-PCR方法敏感性約高100倍。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)測(cè)定每一稀釋度病毒RNA的Ct值，進(jìn)而與原濃度的對(duì)數(shù)值線性回歸作圖。結(jié)果在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，樣品的濃度與對(duì)應(yīng)的Ct值呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)關(guān)系，其回歸曲線的斜率為-3.354 4，截距為32.928，相關(guān)系數(shù)R2為0.9965。鑒別TGEV與PRCV的檢測(cè)方法也呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，回歸曲線斜率為-3.348，截距為34.173，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 9。說(shuō)明建立的檢測(cè)方法相關(guān)性良好，可以用于病毒RNA的定量檢測(cè)（圖 4、圖 5）。

2.5 特異性試驗(yàn)

利用本實(shí)驗(yàn)所建立的定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果TGEV與PRCV呈現(xiàn)陽(yáng)性，其他均為陰性。再對(duì)其呈現(xiàn)陽(yáng)性的用鑒別TGEV和PRCV的檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果僅TGEV呈陽(yáng)性，而PRCV則呈陰性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)不同濃度TCID50病毒核酸用所建立的檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果如表1，對(duì)通用檢測(cè)方法不同試驗(yàn)獲得的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差位于0.31~0.56，變異系數(shù)為1.0%~2.3%；如表2，對(duì)鑒別TGEV和PRCV的檢測(cè)方法，不同試驗(yàn)獲得的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差位于0.4~0.5，變異系數(shù)為1.3%~1.9%，證實(shí)所建立的方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可以滿足檢測(cè)的需要。

表1 TGEV對(duì)不同濃度TCID50RNA檢測(cè)的重復(fù)性

2.7 建立方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)3個(gè)豬場(chǎng)送檢的39份樣品進(jìn)行熒光定量RTPCR檢測(cè)，并和普通RT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，兩種方法檢測(cè)結(jié)果完全吻合，檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率為20.5%（8/39）。說(shuō)明國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)里感染豬傳染性胃腸炎病毒比較普遍，情況較嚴(yán)重。

3 討論

熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。這是近幾年一種新型的核酸定性定量技術(shù)，靈敏度高，特異性好，又具有可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、速度快、操作簡(jiǎn)單、污染少等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前病毒、細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)新方向。根據(jù)采用的熒光材料不同，熒光定量PCR分為SYBR Green I染料法、TaqMan探針?lè)?、分子信?biāo)法、雜交探針?lè)ǖ萚6]。其中，SYBR Green I染料與任何雙鏈DNA都可結(jié)合，容易產(chǎn)生非特異性熒光，而TaqMan探針?lè)ň哂懈咛禺愋裕c分子信標(biāo)法等相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，且重復(fù)性好，因此被普遍使用，本研究也使用本方法。

本試驗(yàn)以TGEV N基因?yàn)榘谢蛐蛄性O(shè)計(jì)了檢測(cè)TGEV的特異性引物和探針序列，建立了用于快速檢測(cè)TGEV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法。但由于TGEV與PRCV具有很高的同源性，針對(duì)N基因?yàn)榘谢虻臋z測(cè)方法區(qū)別不出TGEV與PRCV，因此又建立了針對(duì)PRCV的缺失區(qū)域?yàn)榘谢虻倪M(jìn)一步的檢測(cè)方法，在檢測(cè)中，第一步檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)則進(jìn)行第二步檢測(cè)，來(lái)區(qū)分TGEV與PRCV，提高了檢測(cè)TGEV的準(zhǔn)確性。本方法的檢測(cè)敏感性達(dá)到0.61TCID50，與常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法相比，靈敏度高100倍，且假陽(yáng)性低，不易污染，擴(kuò)增與檢測(cè)一步完成，不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳等后期處理，操作更簡(jiǎn)便。

利用本試驗(yàn)建立的TaqMan探針熒光定量RTPCR檢測(cè)方法，可以對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒感染發(fā)病豬早期進(jìn)行快速檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有重要的臨床實(shí)用意義。

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