張沖，劉祥，陳計(jì)巒

（1.新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（天津），天津 300384）

食品中微生物檢測(cè)新技術(shù)研究進(jìn)展

張沖1，劉祥2，*，陳計(jì)巒1

（1.新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（天津），天津 300384）

食品微生物是影響食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越來(lái)越多。但致病菌往往共存于復(fù)雜的生物體系中，且數(shù)量極少、致病性高，因此，微生物檢測(cè)方法要有高靈敏度、特異性以及較短的分析時(shí)間，現(xiàn)有的成熟檢測(cè)技術(shù)尚難以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)，因而許多新的檢測(cè)方法已成為研究的熱點(diǎn)。從微生物檢測(cè)的角度出發(fā)，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、疊氮溴化乙錠聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、可視化基因芯片、熒光標(biāo)記噬菌體等近年來(lái)出現(xiàn)的新型檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行論述，并分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；疊氮溴化乙錠聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；可視化；熒光標(biāo)記；基因芯片；噬菌體

進(jìn)入21世紀(jì)后，我國(guó)對(duì)于食品中微生物的檢測(cè)、鑒定仍采用傳統(tǒng)的方法，停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型水平，這些方法對(duì)微生物的檢測(cè)特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣耗時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測(cè)和防控。因此，從食品安全現(xiàn)狀和存在的關(guān)鍵問(wèn)題出發(fā)，研究我國(guó)食品安全中的關(guān)鍵技術(shù)，建立符合我國(guó)國(guó)情的食品安全技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)體系，及時(shí)有效地控制和預(yù)防食源性致病菌的傳播己迫在眉睫。本文對(duì)近10年發(fā)展的最新檢測(cè)技術(shù)做了系統(tǒng)的比較和綜述，旨在為今后該方法的研究應(yīng)用提供一定的參考。

1 微生物檢測(cè)的意義

食品微生物檢測(cè)方法為食品檢測(cè)必不可少的重要組成部分。首先，它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否適用的科學(xué)依據(jù)之一。其次，通過(guò)食品微生物檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度作出正確的評(píng)價(jià)，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類、動(dòng)物的食物中毒的防治措施。再次，食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時(shí)，它對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟(jì)損失，保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟(jì)上的重大意義。

2 可視化基因芯片技術(shù)

基因芯片以其高靈敏度、高通量的特點(diǎn)逐漸成為致病菌檢測(cè)研究的熱點(diǎn)，但普通的基因芯片在雜交反應(yīng)結(jié)束后還需要使用熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，這就給配備簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)室在使用上造成了一定的困難。為了解決基因芯片結(jié)果處理這一問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了一種新的芯片技術(shù)——可視芯片技術(shù)。其原理是在酶的催化作用下產(chǎn)生的沉淀，沉積在芯片表面，使芯片的厚度發(fā)生變化，致使反射在芯片上的光的波長(zhǎng)發(fā)生改變，由此可以通過(guò)芯片上顏色的變化來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Ostroff[1]等首先闡述了可視芯片的原理，然后利用人工合成了金黃色葡萄球菌mecA基因，并同時(shí)合成了單個(gè)序列錯(cuò)誤的片段，將它們用于單核苷酸錯(cuò)配的區(qū)別實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果表明，可視芯片對(duì)區(qū)分不同的序列有很好的準(zhǔn)確性，檢測(cè)的濃度可以達(dá)到5 pmol/L；Jenison Robert[2]等對(duì)與捕獲探針結(jié)合的芯片表面進(jìn)行了改良，并將該技術(shù)用于IL-6，IL-1β及INF-γ 3種細(xì)胞因子的鑒別，以及ΔF508，G542X，G551D與N1303K型突變的SNP鑒別，發(fā)現(xiàn)可視芯片特異性高，準(zhǔn)確性好，在混合檢測(cè)中無(wú)交叉反應(yīng)的情況出現(xiàn)；Zhong X[3]等利用可視芯片技術(shù)對(duì)MIF啟動(dòng)子的SNP差異進(jìn)行了檢測(cè)，并通過(guò)毛細(xì)管電泳法進(jìn)行了驗(yàn)證，在30個(gè)樣品中，只有1個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果與毛細(xì)管電泳結(jié)果不同，其它的檢測(cè)結(jié)果都與毛細(xì)管電泳結(jié)果一致。

可視芯片依賴于引物的擴(kuò)增和探針的特異性結(jié)合，設(shè)計(jì)和篩選有效的、特異性強(qiáng)的引物和探針是建立可視芯片檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵，但這具有一定的難度；在理論上如果可視探針產(chǎn)生藍(lán)色的雜交信號(hào)則即為陽(yáng)性信號(hào)，但在實(shí)際檢測(cè)中，背景和其它沒(méi)有發(fā)生雜交反應(yīng)的位點(diǎn)也可能會(huì)產(chǎn)生沉淀的堆積而造成表面顏色的改變?？梢曅酒瑱z測(cè)技術(shù)雖然還不夠完善，但其既有基因芯片快速、準(zhǔn)確、高效、高通量的特點(diǎn)，又可以擺脫昂貴的基因芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)備的限制，因此已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

3 熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)

熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)是根據(jù)噬菌體特異性侵染宿主菌的原理，選用一種合適的染色劑將噬菌體的核酸染色標(biāo)記，然后用標(biāo)記過(guò)的噬菌體侵染相應(yīng)的宿主菌，噬菌體吸附在其宿主菌表面后，隨即將標(biāo)記過(guò)的核酸注入宿主細(xì)胞，隨著越來(lái)越多的噬菌體核酸的注入，細(xì)胞內(nèi)熒光隨著熒光素的增多而增強(qiáng)，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測(cè)。

Mosier-boss[4]等在前人的基礎(chǔ)上，將熒光染料YOYO-1更換為靈敏度較高，且對(duì)噬菌體結(jié)構(gòu)和功能都無(wú)破壞性的SYBR gold核酸染料標(biāo)記沙門(mén)氏菌噬菌體P22，成功的檢測(cè)到了沙門(mén)氏菌LT2株，同時(shí)與DAPI、EB、YOYO-1等核酸染料作對(duì)比，結(jié)果顯示SYBR gold染劑是實(shí)驗(yàn)效果最好的核酸染料；Phea M H[5]與Flajshans M[6]等分別將SYBR greenⅠ和SYBR greenⅡ用于大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、以及李斯特菌的檢測(cè)，均已成功檢出，且靈敏度較高，改方法完全能用于實(shí)際生產(chǎn)中微生物的檢測(cè)。

多數(shù)噬菌體與宿主呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，雖特異性極高，但宿主范圍較窄，且噬菌體與宿主作用的裂解機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究，所以該技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用相對(duì)較少。但是熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)，檢測(cè)周期短，能區(qū)分死活細(xì)菌，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)前無(wú)需將各細(xì)菌純化，預(yù)增菌后即可用于檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程可在8 h內(nèi)結(jié)束，且多個(gè)細(xì)菌檢測(cè)可同步進(jìn)行，因此該項(xiàng)技術(shù)在食源性致病菌的檢測(cè)中有著廣闊的發(fā)展前景。

4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR是體外選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的技術(shù)，就是模板DNA、引物以及4種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）在DNA聚合酶的催化作用下所發(fā)生的酶促集合反應(yīng)，由變性—退火—延伸3個(gè)步驟組成，應(yīng)用該技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)特定DNA序列作百萬(wàn)倍擴(kuò)增[7]。

目前在食品微生物檢測(cè)中運(yùn)用的PCR技術(shù)，大多是基于DNA水平的檢測(cè)技術(shù)，雖然快速特異，靈敏度較高，但由于死菌中的DNA降解較慢，很容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[8]。因此，建立一種快速、靈敏高、特異性強(qiáng)，同時(shí)還能區(qū)分死、活菌，避免常規(guī)PCR中假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的方法很有必要。

4.1 EMA-PCR

EMA（ethidium bromide monoazide）是一種熒光插入型的核酸（DNA）結(jié)合染料，這種染料最顯著的特點(diǎn)是當(dāng)樣品中死活細(xì)胞共同存在時(shí)，它能夠選擇性地與死細(xì)胞中的DNA共價(jià)結(jié)合。由于活菌的細(xì)胞膜比較完整，EMA不能滲透到活菌細(xì)胞內(nèi)部；但在細(xì)菌死亡之后，細(xì)胞膜遭到破壞，EMA能夠很容易地滲透到細(xì)胞內(nèi)部，嵌插到DNA分子的雙螺旋上[9]。有研究表明，死亡的細(xì)菌暴露于EMA染液中僅需1 min，EMA便可透過(guò)細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，插入DNA的雙螺旋，發(fā)生共價(jià)交叉偶合作用，使其不能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)[10-11]，從而導(dǎo)致死細(xì)胞內(nèi)部的DNA在接下來(lái)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中被抑制。

大量研究表明，EMA與PCR相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，能夠有效地抑制樣品中死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，更精確地檢測(cè)到樣品中的活菌細(xì)胞[12-15]。Weimin Gu[12]等利用EMAPCR技術(shù)檢測(cè)死、活類志賀鄰單胞菌共存的菌液，發(fā)現(xiàn)EMA能夠抑制志賀鄰單胞死菌DNA的擴(kuò)增，無(wú)假陽(yáng)性的出現(xiàn)；Wang S.[9]等將創(chuàng)傷弧菌實(shí)驗(yàn)樣品用EMA染液處理后，用real-time PCR成功的檢測(cè)出樣品中的活菌，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度是3μg/mL，完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度為2.5μg/mL；Pilar Viscogliosi[16]等用V-PCR（viability PCR：EMA與quantitative real-time PCR相結(jié)）對(duì)水中的軍團(tuán)桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，并與普通培養(yǎng)法以及Q-PCR對(duì)比，發(fā)現(xiàn)V-PCR所得菌數(shù)高于普通培養(yǎng)法所得菌數(shù)，低于Q-PCR所得菌數(shù)，由此證明，EMA-PCR技術(shù)不僅能夠避免常規(guī)PCR中死菌帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果，又能避免培養(yǎng)法中處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）菌帶來(lái)的假陰性結(jié)果；Wang L[17]等用EMA-real-time PCR的方法檢測(cè)雞肉與雞蛋中活的沙門(mén)氏菌，并與常規(guī)PCR對(duì)照，結(jié)果顯示無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)，并將其檢出限降低至10 cfu/mL。

EMA-PCR與傳統(tǒng)PCR相比，其最大優(yōu)勢(shì)在于在擴(kuò)增時(shí)具有選擇性，能夠抑制PCR對(duì)死菌中的DNA擴(kuò)增，只擴(kuò)增其活菌的DNA[18-19]。但是，EMA選擇死活菌的能力仍然受到一些質(zhì)疑，EMA對(duì)微生物PCR擴(kuò)增體系的影響還有很多地方尚不明確[20-23]，例如，EMA會(huì)抑制處于損傷狀態(tài)的非死亡菌的擴(kuò)增、EMA自身會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生破壞等。但EMA與Q-PCR相結(jié)合的方式，無(wú)疑為食品中微生物的檢測(cè)提供了一個(gè)新思路，既能夠彌補(bǔ)基于DNA水平的PCR法無(wú)法選擇活死細(xì)胞的擴(kuò)增不足，又具有常規(guī)PCR檢驗(yàn)的高靈敏度、高特異性，因而具有較大的實(shí)用和推廣價(jià)值。

4.2 RT-PCR

RT-PCR就是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的一種新的擴(kuò)增方法。首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，即用引物與mRNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA鏈，最后再以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，借助PCR技術(shù)擴(kuò)增合成目的片段。其最大優(yōu)點(diǎn)在于，利用了只有活菌的DNA才能轉(zhuǎn)錄出RNA的原理，用RNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA做為擴(kuò)增的目標(biāo)片段，以解決死菌DNA帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。

Vijay K.Sharma[24]采用rRT-MPCR（real-time reverse transcription multiplex polymerase chain reaction）技術(shù)，用2對(duì)引物和探針對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè)分析后，認(rèn)為以總RNA為模板，rfbE與eae為靶點(diǎn)的RTPCR是一種特異性強(qiáng)，靈敏度高的快速檢測(cè)方法；Matsuda[25]等以傳統(tǒng)培養(yǎng)法以及常規(guī)PCR為對(duì)照，用定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Q－RT－PCR）方法檢測(cè)到了處于活的非培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）的C.perfringens菌，說(shuō)明RT-PCR具有較強(qiáng)地區(qū)分死、活菌的能力；Carlos A.Guzman[26]等用QRT-PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR）方法成功的檢測(cè)出處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)與饑餓狀態(tài)的霍亂弧菌，因此證實(shí)，Q-RT-PCR不僅可以避免常規(guī)PCR在檢測(cè)霍亂弧菌時(shí)出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果，還可以檢測(cè)到代謝較弱的霍亂弧菌，由此證明，基于RNA水平的PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，可以顯示細(xì)菌當(dāng)前的代謝活性，進(jìn)而可以對(duì)細(xì)菌的代謝活性作出科學(xué)的評(píng)估；Narjol Gonzalez-Escalona[27]等用Q-RT-PCR技術(shù)，以沙門(mén)氏菌invA基因?yàn)榘悬c(diǎn)，并設(shè)置myIC內(nèi)參，成功的避免了假陽(yáng)性以及假陰性的出現(xiàn)，并且準(zhǔn)確定量出體系中的活菌數(shù)量，從而證實(shí)，Q-RT-PCR是一種快速而精確的檢測(cè)方法。

RT-PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域，一度被稱為活菌檢測(cè)的“金”標(biāo)準(zhǔn)[28]，但仍有一些不確定因素限制了RT-PCR的使用[29-35]，如樣品的選擇、靶點(diǎn)RNA的選擇、逆轉(zhuǎn)錄體系的選擇、擴(kuò)增方式的差異等。但RNA作為生物活性的標(biāo)志，RT-PCR不僅能夠有效地區(qū)分死活菌，其檢測(cè)結(jié)果還能作為菌體代謝的活性指標(biāo)，因此，RT-PCR有著極其重要的研究?jī)r(jià)值。

5 結(jié)論與討論

與傳統(tǒng)方法相比，這些新的檢測(cè)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，不但快速方便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且能夠檢測(cè)到一些傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)到的病原體；與其它生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比，如：依賴核苷酸序列擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) (ElISA)、免疫金技術(shù)（ICGT）、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)（SPC）等，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。尤其是RT-PCR技術(shù)，不但能夠檢測(cè)到活性較強(qiáng)的細(xì)菌，而且還能夠檢測(cè)到處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌，具有較強(qiáng)的區(qū)分死活菌的能力，其檢測(cè)結(jié)果可作為菌體活性評(píng)估的重要參照，這是其它快速檢測(cè)技術(shù)以及傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)均無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，因而有著不可估量的發(fā)展前景。

總之，這些新的檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面均發(fā)揮著一定的作用，不同的檢測(cè)技術(shù)具有不同的適用范圍，可以滿足差異化的檢測(cè)需求。隨著研究的深入，各種檢測(cè)技術(shù)得到不斷發(fā)展與完善，傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)技術(shù)將逐步被各種簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的新型檢測(cè)技術(shù)所取代。

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New Method for Detecting Microorganisms in Food Progress

ZHANG Chong1，LIU Xiang2，*，CHEN Ji－luan1
（1.College of Food Science and Engineering in Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.National Quality Supervision and Inspection Center of processed foods（Tianjin），Tianjin 300384，China）

Food microbiology is an important factor affecting food safety，foodborne pathogens caused by the increasing number of cases.However，pathogens often coexist in complex biological systems，and few in number，high pathogenicity，therefore，microbial detection methods have high sensitivity and specificity and short analysis time，but our existing detection methods had been difficult microorganisms to achieve real－time，accurate，rapid detection，so many new detection methods had become a research hotspot.The significance of this departure from the microbial detection of RT－PCR，EMA－PCR，gene chip visualization，detection of fluorescent phage and other new technologies were discussed，and analyzes their advantages and disadvantages.

RT－PCR；EMA－PCR；visualization；fluorescent marker；gene chip；phage

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2010QK307）；天津市質(zhì)監(jiān)局科技項(xiàng)目（10-11）

張沖（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，主要從事食品科學(xué)與分子生物學(xué)研究。

*通信作者

2011-07-01