王佳斌，艾江平

(三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000)

長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素的患者有可能出現(xiàn)激素性股骨頭壞死，這在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死原因中位居第一［1，2］。骨保護(hù)素(OPG)和破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)作為破骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子，可直接影響破骨細(xì)胞功效，是骨質(zhì)吸收的共同通路［3，4］?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)主要影響機(jī)體各種組織的發(fā)育和修復(fù)。本研究觀察了長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素致股骨頭壞死患者骨組織中OPG、RANKL、MMP-1、MMP-2、TIMP的表達(dá)變化，探討糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2009年1月～2010年3月在本院接受手術(shù)治療的自愿捐贈(zèng)股骨頭骨組織及骨髓的股骨頸骨折患者29例(對(duì)照組)及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療超過(guò)1周，發(fā)病時(shí)正在接受糖皮質(zhì)激素治療超過(guò)3周或2 a內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素治療)致股骨頭壞死患者30例(研究組)。對(duì)照組男18例、女11例，年齡43～68歲。研究組男20例、女10例，年齡42～67歲，排除酒精性、減壓病等原因造成的股骨頭壞死。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論后批準(zhǔn)。

1．2 標(biāo)本采集及處理 對(duì)照組用小刮匙收集術(shù)中取出的股骨頭松質(zhì)骨，研究組小刮匙或骨穿針取股骨頭松質(zhì)骨，置4%多聚甲醛溶液固定。從兩組患者大粗隆穿刺抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，采用貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs):骨髓液中加高糖DMEM培養(yǎng)液，離心后棄上清，收集細(xì)胞;按1×109/L的標(biāo)準(zhǔn)接種于含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);2 d后更換培養(yǎng)基，至培養(yǎng)第8～10天，收集BMSCs。

1．3 BMSCs中OPG、RANKL mRNA的檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。根據(jù)目的基因在Genbank中的己知序列，采用Primer5．0軟件自行設(shè)計(jì)引物，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，合成cDNA第1鏈，進(jìn)行PCR。通過(guò) ABIprism 7300SDS軟件計(jì)算 OPG、RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1．4 股骨頭松質(zhì)骨中MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SABC法。骨組織石蠟切片，微波修復(fù)抗原，PBS沖洗。滴加正常山羊血清，封閉液，室溫20 min;滴加Ⅰ抗，4℃過(guò)夜后PBS沖洗;滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，PBS沖洗;滴加試劑SABC，PBS沖洗。DAB顯色，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白定位于骨細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜上，呈棕黃色顆粒;取其光學(xué)顯微鏡圖像，通過(guò)Image-Pro Plus7．0分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，每張切片均采用5個(gè)圖像測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的積分光密度值(IOD值)，取均值，IOD值越大表示陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組BMSCs的OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量為0．43 ±0．12、RANKL mRNA 為 1．48 ±0．32，對(duì)照組分別為0．72 ±0．05、0．96 ±0．43，兩組相比，P 均＜0．05。研究組骨組織中 MMP-1、MMP-2、TIMP 蛋白的 IOD 值分別為 329．43 ± 75．54、324．53 ±65．53、68．32 ± 18．85，對(duì)照組分別為 189．42 ±25．58、145．43 ±25．76、275．23 ±48．43，兩組相比，P均 ＜0．05。

3 討論

在無(wú)菌性股骨頭壞死的病因中，最主要的因素為長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用。糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死的發(fā)病主要與血管內(nèi)凝血、脂質(zhì)代謝紊亂、股骨頭內(nèi)高壓、基因表達(dá)異常及骨質(zhì)疏松等有關(guān)。

RANKL主要由成骨細(xì)胞前體及成骨細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)旁分泌方式與其受體結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和活化。OPG在骨組織中為RANKL的受體，能夠與RANKL結(jié)合，而阻止RANKL與RANK的結(jié)合，進(jìn)而阻止了破骨細(xì)胞的生成和活化［5］。本研究結(jié)果顯示，研究組BMSCs的OPG mRNA較對(duì)照組降低、RANKL mRNA較對(duì)照組增高，這將有利于破骨細(xì)胞的生成及其活性的提高，使骨吸收加劇。這可能是激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制之一。

MMP及其特異性抑制因子TIMP參與降解各種組織細(xì)胞外基質(zhì)。MMP-1、MMP-2是骨吸收過(guò)程中降解骨基質(zhì)有機(jī)物成分(如Ⅰ型膠原)的主要蛋白酶。研究［6，7］表明，MMP-1、MMP-2 分泌增多和(或)TIMP分泌減少，將促進(jìn)骨基質(zhì)的降解。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，研究組骨組織中 MMP-1、MMP-2蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而TIMP的表達(dá)則明顯減弱，這將會(huì)造成骨組織的破壞。這可能也是激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制之一。

總之，長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭缺血性壞死可能與OPG/RANKL、MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡失調(diào)有關(guān)。糖皮質(zhì)激素可能直接或間接破壞OPG/RANK、MMP/TIMP系統(tǒng)的平衡，上調(diào)破骨細(xì)胞活性，加速骨細(xì)胞凋亡和骨基質(zhì)降解，促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死;或通過(guò)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，使股骨頭不能承受正常壓力負(fù)荷、局部凝血異常而缺血壞死［8］。

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