蔡英蘭，樸麗花，張默函，姜京植，金 政

(延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

糖尿病患者普遍存在胃腸功能紊亂，報(bào)道約75%的糖尿病患者有胃腸道癥狀，如腹脹、上腹不適、便秘等［1］，導(dǎo)致降糖藥吸收遲滯，血糖控制不良，還可能引起低血糖等。但糖尿病致胃腸動(dòng)力紊亂的機(jī)理仍不完全清楚。胃腸道中存在鈉尿肽(NP)—鈉尿肽受體(NPR)-B/pGC-cGMP和 NO-sGC-cGMP兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［2］，均參與胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)。研究表明，胃腸道內(nèi) NP及NPR對(duì)豚鼠、大鼠和人胃平滑肌自發(fā)性運(yùn)動(dòng)均發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用［3，4］。本研究組前期研究證明，糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠C型鈉尿肽(CNP)抑制胃竇平滑肌收縮的作用明顯增強(qiáng)［5］。我們于2009年12月～2010年5月進(jìn)行本研究，擬繼續(xù)探討糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠胃竇平滑肌對(duì)CNP敏感性增強(qiáng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量220～250 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma);CNP、NPR-B抗體(Santa Cruz);RM-6240多道生理信號(hào)記錄系統(tǒng)(中國(guó)成都儀器廠);TD-2000型真彩病理細(xì)胞顯微分析系統(tǒng)(北京天地百年科技有限責(zé)任公司)。

1.2 動(dòng)物模型的制備 Wistar大鼠禁食12 h，自由飲水，腹腔注射STZ(65 mg/kg)制備糖尿病動(dòng)物模型。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模成功后大鼠均單籠飼養(yǎng)4周，自由進(jìn)食、飲水。將大鼠擊頭致昏，沿中線剖腹取全胃，放入4℃氧飽和的 Kerb’s液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.75 mmol/L、CaCl22.54 mmol/L、KH2PO41.19 mmol/L、MgSO41.19 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，充以95%O2和5%CO2的混合氣體，pH 7.2～7.4)中，沿胃小彎側(cè)剪開(kāi)，漂洗出胃內(nèi)容物。小心剪去黏膜層，在距幽門近口端5 mm處沿胃竇環(huán)行肌纖維走行方向剪取2 mm×12 mm的環(huán)行肌條。取下的肌條放置于Kerb’s液垂直灌流槽中，其一端固定在鉑絲鉤上，另一端與張力換能器相連，灌流槽內(nèi)溫度維持在37℃，并持續(xù)供給95%O2和5%CO2的混合氣體。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)均給予1 g前負(fù)荷，在氧飽和的Kerb’s液灌流槽中孵育40 min，待肌條自發(fā)性收縮穩(wěn)定后，通過(guò)RM-6240多道生理信號(hào)記錄系統(tǒng)同時(shí)記錄正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠胃竇平滑肌收縮活動(dòng)、肌條收縮運(yùn)動(dòng)的振幅和頻率。將收縮頻率明顯慢于正常的大鼠列入糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠模型。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 取胃竇部組織用4%甲醛緩沖液固定24 h。常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。兔CNP抗體1∶600稀釋，NPR-B抗體1∶600稀釋。觀察正常對(duì)照組及糖尿病組大鼠胃竇組織中CNP的分布。選取部分胃組織切片作為陰性對(duì)照(用PBS替代兔CNP抗體)，與其他切片在同一條件下進(jìn)行染色。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 兩組隨機(jī)抽取3張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，按胃竇平滑肌CNP及NPR-B顯色程度分弱、中、強(qiáng)3種，分別計(jì)1、2、3分，用TD-2000醫(yī)用真彩色圖像分析軟件計(jì)算相應(yīng)范圍，將顯色程度和范圍換算成顯色指數(shù)。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍。

2 結(jié)果

2.1 胃竇平滑肌CNP分布 正常對(duì)照組及糖尿病組大鼠胃竇組織均有CNP蛋白陽(yáng)性表達(dá)，即可見(jiàn)棕色顆粒，主要見(jiàn)于肌層。正常對(duì)照組CNP蛋白顯色指數(shù)為(41.26±0.71)%，糖尿病組為(41.71±0.21)%，兩者CNP蛋白顯色指數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

2.2 胃竇平滑肌NPR-B的分布 正常對(duì)照組胃竇平滑肌細(xì)胞NPR-B呈陽(yáng)性，可觀察到散在分布的棕色顆粒，NPR-B蛋白顯色指數(shù)為(17.63±1.49)%;糖尿病組胃竇平滑肌細(xì)胞NPR-B也呈陽(yáng)性，但與正常對(duì)照組相比呈陽(yáng)性的棕色顆粒明顯增多、染色明顯加深，NPR-B蛋白顯色指數(shù)為(30.67±1.59)%。兩組NPR-B蛋白顯色指數(shù)比較P＜0.01。

3 討論

NP通過(guò)與細(xì)胞膜上的NPR結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用［6］。NPR 主要有 3種:NPR-A、NPR-B 和 NPRC，均屬于膜受體。CNP主要與NPR-B結(jié)合［7］。NP抑制胃平滑肌的作用機(jī)制主要是通過(guò)NP-NPR-B/pGC-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使Ca2+外流，膜電位超極化［5～7］。正常生理?xiàng)l件下 CNP作用強(qiáng)于 ANP和BNP，且糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠胃竇平滑肌對(duì)CNP的敏感性顯著增強(qiáng)［5］。

糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中NP-NPR-B/pGC信號(hào)系統(tǒng)的改變起重要作用。Walther等［8］研究結(jié)果表明糖尿病小鼠心肌組織NPR-B信號(hào)增加，可導(dǎo)致心肌癥的發(fā)生、發(fā)展。Christoffersen等［9］報(bào)道糖尿病大鼠血管組織中ANP-NPR-A信號(hào)系統(tǒng)和CNPNPR-B信號(hào)系統(tǒng)上調(diào)，并阻止高血壓的發(fā)生、發(fā)展。此外，糖尿病大鼠腎組織ANP mRNA表達(dá)增強(qiáng)可能是為了參與適應(yīng)糖尿病高糖高滲狀態(tài)［10］。這些結(jié)果提示糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠胃組織中可能發(fā)生這些信號(hào)系統(tǒng)的改變。

本研究觀察到，CNP主要分布在胃竇平滑肌層，環(huán)行肌和縱行肌均有分布，并通過(guò)與平滑肌細(xì)胞膜上的NPR-B結(jié)合而發(fā)揮生理作用。腹腔注射STZ飼養(yǎng)4周的糖尿病組與正常對(duì)照組大鼠相比，胃竇平滑肌組織中CNP分布無(wú)明顯差異，而NPR-B在糖尿病組大鼠胃竇平滑肌中分布明顯增多。NPR-B上調(diào)可使胃竇平滑肌cGMP濃度增高，cGMP濃度增高勢(shì)必增強(qiáng)平滑肌的舒張作用，最終將導(dǎo)致胃動(dòng)力障礙。以上結(jié)果提示，腹腔注射STZ飼養(yǎng)4周的糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠胃中CNP-NPR-B/pGC-cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起重要作用，其中NPR-B上調(diào)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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