張慶明，王玉平，雷連成

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林長春，130062)

水貂阿留申病(AD)是由細小病毒科阿留申水貂病毒屬水貂阿留申病毒(ADV)引起的，主要侵染水貂、病程緩慢的傳染性疾病。阿留申病毒對水貂的健康有嚴重的影響，能夠使水貂呈現(xiàn)多種不同的臨床癥狀。新生水貂表現(xiàn)為急性肺炎，成年水貂則表現(xiàn)為伴有高γ－球蛋白和腎小球腎炎等癥狀的慢性免疫系統(tǒng)失調(diào)。ADV主要侵染水貂，不僅感染阿留申基因型水貂，其他所有基因型的水貂都易感，只是非阿留申型水貂的癥狀較輕。

1 病原學

水貂阿留申病毒(ADV)屬于細小病毒科，阿留申水貂病毒屬，無囊膜，直徑22～25 nm，不含脂質(zhì)和糖類，結(jié)構(gòu)堅實，為單鏈線性DNA病毒。該病毒因其堅實緊密的形態(tài)結(jié)構(gòu)而對外界物理化學因素的抵抗力非常強。能抵抗乙醚和氯仿，且耐熱，80℃時可存活1 h，90℃時可耐受10 min，100℃ 3 min仍能保持感染性。在5℃時，福爾馬林體積分數(shù)為0．03的溶液約2周處理仍有活力，耐受4周才滅活。在pH 2．8～10．0的環(huán)境中均能保持活力，但蛋白酶處理時，病毒滴度明顯下降。可被紫外線、0．5 mol/L的鹽酸、5 g/L的碘溶液及20 g/L的氫氧化鈉溶液滅活［1～4］。

Porte等［5］證明，阿留申病病毒可以在他們所試驗的39種細胞中的5種水貂細胞株、一種非洲綠猴腎細胞和人的細胞株WI－38中有限地產(chǎn)生阿留申病毒抗原。在感染后2 d，抗原發(fā)現(xiàn)于核內(nèi)，在感染后3～4 d，小量的抗原有時也見于胞漿內(nèi)，通常僅1%的細胞含有抗原，感染4 d以后，則難以檢測到抗原。1977年，Hahn等［6］在貓腎細胞系CRFK內(nèi)，通過免疫熒光方法確定核內(nèi)存在病毒抗原。1980年，Bloom等［7］報道阿留申病病毒(ADV－G)在31．8℃的條件下可于CRFK細胞內(nèi)增殖。

2 分子生物學

1988年，Bloom等［8］完成了ADV－G亞型的基因序列測定，其基因共包含4 801個核苷酸?；蚪M的兩端均存在回文序列，并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，共有4個編碼蛋白的開放閱讀框架(OFR)，分別為:左開放閱讀框架(L－ORF)、右開放閱讀框架(R－ORF)和2個短的可編碼小于10 ku多肽的中間開放閱讀框架(MORF1 和 MORF2)。L－ORF 對應非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)，R－ORF 對應結(jié)構(gòu)蛋白1，2(VP1，VP2)，M－ORF對應其他非結(jié)構(gòu)蛋白。

ADV的復制位點位于細胞核中，發(fā)生于宿主細胞的復制間期(S期)［9］。ADV－G在CRFK細胞中復制時，由位于3MU的啟動子(P3啟動子)啟動合成Rl，R2，R2′，和RX等4種mRNA，而位于36MU的P36啟動子負責啟動R3mRNA的合成。

3 發(fā)病機理

從1940年發(fā)現(xiàn)AD以來，國內(nèi)外學者針對AD的發(fā)病機理進行了大量的研究工作?；谀壳皣鴥?nèi)外學者的研究結(jié)論，ADV感染所造成的宿主動物的損傷主要可歸結(jié)為兩個方面:

阿留申病是典型的免疫復合物病。動物體感染ADV后，體內(nèi)存在高滴度的抗病毒抗體，但病毒并不被IgG中和。在慢性感染水貂血清中的阿留申病病毒雖被抗體結(jié)合，但不能被中和，病毒也不從宿主體內(nèi)被清除出去。這些免疫復合物在血液中循環(huán)，沉積于腎小球及其它器官動脈管壁的基底膜，引起腎小球及其它組織的損害，病理表現(xiàn)為腎小球腎炎及動脈血管炎等。

巨噬細胞為ADV侵染的靶細胞。ADV對巨噬細胞的侵染，引發(fā)了宿主動物免疫機能紊亂。巨噬細胞作為參與機體免疫應答的主要免疫細胞之一，ADV在其體內(nèi)的復制，必將對其功能產(chǎn)生一定的影響。而巨噬細胞功能紊亂所引發(fā)的連鎖反應，可能最終導致漿細胞增多和高水平γ－球蛋白的出現(xiàn)。

4 診 斷

阿留申病的實驗室診斷包括以下幾個方面:

4．1 病原學檢查

1976年，Brummerstedr，E［10］在電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有2種不同顆粒，典型的病毒顆粒約22～24 nm，而較小的顆粒為10～12 nm，這種較小顆?？赡転殍F蛋白。常國權(quán)等［11］采用直接電鏡和膠體金免疫電鏡技術(shù)對疑似病料進行了檢測。對二者檢測結(jié)果比較后認為，前者雜質(zhì)較多，成像不清晰，而后者則簡單快速，敏感特異，而且可以對病毒在細胞內(nèi)進行定位。阿留申病毒能在睪丸細胞和腎細胞、鼠和雞胚等原代細胞上生長，也可在貓腎細胞上繁殖并產(chǎn)生細胞病變。但病原學的檢測多用于實驗研究，很少應用于臨床。

4．2 血清學檢查

目前在水貂阿留申病研究的檢疫技術(shù)中以血清學診斷尤為重要。

4．2．1 碘凝集試驗(IAT) 該方法是根據(jù)病貂血清中γ－球蛋白顯著增多，遇到碘試劑可以發(fā)生凝集反應的原理而設計的。但該方法特異性差，結(jié)核病及其他肝腎疾病均呈現(xiàn)陽性，因此該法始終未能普及。

4．2．2 對流免疫電泳試驗(CIEP) 該方法是利用特異性阿留申病毒抗原(組織抗原或細胞抗原)能與被檢水貂血清中抗體進行反應的原理設計的。在電場力作用下，抗原由陰極向陽極遷移，而抗體則反向運動，在瓊脂糖凝膠中抗原和抗體結(jié)合成清晰的灰白色沉淀線則證明為陽性。

4．2．3 淋巴細胞酯酶標記 林學岷等［12］采用ANHE染色法對健康貂和患病貂做了T，B淋巴細胞的測定試驗。結(jié)果表明，AD水貂的T，B淋巴細胞與健康水貂的T，B淋巴細胞值差異明顯，T淋巴細胞明顯降低。據(jù)B．Aasted等［13］報道，B淋巴細胞呈ADV的最初靶細胞，使ADV復制進入轉(zhuǎn)化階段，致使感染的B淋巴細胞大量增生和分化。因此，淋巴細胞酯酶標記可作為水貂的ADV早期診斷的可靠方法。但此法目前尚未推廣使用。

4．2．4 膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細管作用原理，以膠體金為標記物來顯示結(jié)果的一種新型的檢測技術(shù)。徐磊［14］通過水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原區(qū)的原核表達產(chǎn)生的抗原作為標記抗原，初步建立了水貂阿留申病膠體金層析診斷方法，并與對流免疫電泳法進行了比較，顯示了較好的敏感性和特異性。

除上述幾種方法外，水貂阿留申病的血清學診斷還有間接免疫熒光試驗法、補體結(jié)合試驗等，但因操作方法均較復雜，尚未用于獸醫(yī)臨床實踐。

4．3 分子生物學診斷

4．3．1 聚合酶鏈式反應(PCR) PCR技術(shù)是利用特異性的引物對靶序列進行體外擴增的一種方法，該技術(shù)從理論上可對微量(最少可為1個核酸拷貝)的靶DNA進行擴增，用于病毒檢測的準確性和特異性遠超過CIEP方法。對于母貂分娩時可能出現(xiàn)的死胎、木乃伊胎或剛出生的幼仔，由于很難獲得血清樣品及可能存在的其它一些干擾因素，在實驗室診斷中不能使用CIEP進行ADV抗體檢測，但PCR方法可以完成這一檢測工作。

由于PCR檢測成本較高等因素的限制，用于ADV感染情況檢測的樣本數(shù)不夠大，檢測的結(jié)果并不一定能夠十分準確地反映一個地區(qū)養(yǎng)殖水貂ADV感染的實際情況，僅可以對國內(nèi)水貂ADV感染情況的嚴重性給以一定的參考。

4．3．2 基因檢測芯片 朱善元等［15］根據(jù)已發(fā)表的水貂阿留申病病毒的序列，在現(xiàn)有的探針反相雜交技術(shù)的基礎上，融合基因芯片的基本原理和核酸分子堿基互補配對的原則，制作成疾病診斷基因芯片。結(jié)果表明，基因芯片的檢出率比ELISA方法高17%。該方法可克服ELISA法和碘凝集方法需要制備新鮮血清和敏感性差等問題;可在機體產(chǎn)生抗體之前，早期準確地檢測病原，這對預防、控制水貂阿留申病疫情的蔓延十分有利;由于在每份檢測樣品中都設立了陰性對照和陽性對照，可有效地克服PCR易被污染的缺點?；蛐酒椒梢宰鳛殍b別水貂阿留申病的一種新途徑。

5 防 治

阿留申病毒對水貂養(yǎng)殖業(yè)是一種嚴重的威脅，但是基于疫苗的保護性控制的研究嘗試始終沒有取得成功。因ADV的特殊的致病機理，其疫苗的研制開發(fā)一直是動物醫(yī)學界很棘手的問題。ADV感染水貂后，水貂體內(nèi)不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的中和抗體，而產(chǎn)生的多數(shù)抗體不僅不能中和病毒的毒力，反而通過介導抗體依賴性增強作用，進一步幫助ADV對靶細胞的侵染。由于病毒抗原與抗體形成的復合物特有的理化特點可導致免疫復合物逃避巨噬細胞的吞噬而沉積并引發(fā)腎小球腎炎和動脈炎。這些都對基于病毒粒子構(gòu)建疫苗帶來了許多的困難。

近些年DNA疫苗又成為一個新的研究熱點，其原理是將編碼引起免疫應答的目的基因片段插入質(zhì)粒載體中，然后將重組質(zhì)粒直接導入機體，它通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達目的抗原，進而誘導產(chǎn)生保護性免疫應答。它能同時誘導機體的體液免疫和細胞免疫，疫苗穩(wěn)定，對保存溫度要求不高，基因疫苗較之傳統(tǒng)疫苗顯示出了許多優(yōu)點。

基于以上優(yōu)點，有人嘗試構(gòu)建了NSl基因的DNA疫苗并檢驗了對ADV的保護作用。結(jié)果表明，將NSl的DNA疫苗與NSl蛋白疫苗配合同時免疫動物能起到部分保護作用［16］?；谝陨显?，要想通過研制疫苗有效預防AD還有待時日。

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