童金英(綜述），朱清仙(審校）

（南昌大學a.研究生院醫(yī)學部2008級；b.基礎醫(yī)學院，南昌 330006）

1962年F.M.Ritossa將果蠅的培養(yǎng)溫度提高后，發(fā)現(xiàn)了熱休克反應，1974年A.Tissieres等[1]進一步研究分離出熱休克蛋白 （heat shock protein,HSP）。HSP是機體除熱應激外，在寒冷、缺血、機械刺激、有毒化合物等應激條件下迅速合成的一組蛋白質，也稱熱應激蛋白。HSP家族被分為：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子 HSP，其中 HSP70是研究較多的蛋白質之一［2］。近年來國內外學者一直在探索HSP70的特性及其在心臟疾病治療中的作用,HSP70在心肌細胞中的抗凋亡作用和心肌保護作用逐漸被人們所認識[3]。本研究對熱休克蛋白及其對各種應激條件下心肌損傷的保護作用及機制進行綜述。

1 HSP70的分類、結構及生物學特性

1.1 HSP70的家族成員

HSP70的家族成員最多，共有21種蛋白質[4]，大致分為以下 4 類：1）HSP（70），也稱為 HSP72，其主要存在于胞漿中，胞核通常在正常情況下并不表達或表達量很少，但在熱應激或其他應激作用下迅速增加表達，屬于誘導型HSP70；2）熱激同源蛋白70（heat shock cognate 70），也稱為 HSP73，在所有細胞的胞漿和胞核中均有所表達，為結構型HSP70，與HSP70具有高度的序列同源性（95%）和相似的生物化學特性；3）葡萄糖調節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein78,GRP78），存在于內質網胞內；4）GRP75，位于線粒體內。

1.2 HSP70的功能結構

HSP70是一組在進化上高度保守的應激蛋白[4]，具有3個功能域：1）近N端是高度保守的序列，又稱核苷結合域（nudeotide biding dowain,NBD），由 4個結構亞區(qū)組成，結合并水解ATP；2）緊接著是多肽結合域（peptide biding domain,PBD）,屬相對保守序列，包含2個結構亞區(qū)，形成多肽結合袋狀結構，可與底物相結合，識別靶多肽并與之結合調節(jié)其合成的作用；3）近C端是結構多變序列，與特定的蛋白底物結合有關。

1.3 HSP70的生物學特性

目前HSP70被認為是哺乳動物細胞HSP中最重要的，這與它所具有的以下生物學特性密切相關：1）生物界的普遍性。從原核生物到真核生物都有HSP70的表達，同一種生物體內的不同組織內均有表達。2）高度的保守性。不同生物來源的HSP70氨基酸序列有50%～90%同源性。3）正常情況下HSP70在細胞內表達水平較低，而在熱應激或其他應激作用下迅速增加HSP70合成，以提高抗應激能力。4）正常情況下HSP70位于細胞漿，當細胞遭受應激作用時，HSP70迅速移入細胞核內并包圍核仁，胞漿內只有少量表達，而應激消除后細胞處于恢復階段時，細胞核內的HSP70又返回胞漿，在細胞漿內呈低水平表達，再次應激又重新返回細胞核。5）HSP70家族成員均具有與核苷酸特別是與ATP或ADP結合的特性。

2 細胞凋亡

細胞凋亡是指細胞在一定的應激條件下發(fā)生的自主有序的死亡。許多信號刺激可以誘導細胞發(fā)生凋亡,如紫外線照射和電離輻射、抗癌藥物、生長因子缺乏、過度表達某些特定的癌基因等。盡管這些信號以及隨后的反應途徑多種多樣,但現(xiàn)已公認,細胞凋亡后期的共同途徑是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[5]。激活的Caspases可以水解包括細胞調節(jié)、細胞信號轉導、DNA修復、組織平衡、細胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白，從而使細胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學及生物化學特征。

線粒體在細胞凋亡中起著決定性的作用。線粒體在細胞凋亡過程中最重要的一點在于它可釋放能夠激活Caspases的蛋白。從線粒體釋放的細胞色素C與ApaH、Procaspase 9結合在一起形成凋亡體(Apoptosome)，并使caspase-9激活。除細胞色素C之外,線粒體還可釋放其他介導細胞凋亡的分子:Procaspase-3和凋亡誘導因子AIF(Apoptosis-inducing factor)。

3 HSP70與細胞凋亡

S.A.Gordon等[6]實驗發(fā)現(xiàn)，熱休克預處理產生的抗凋亡作用是由HSP70介導的，并能抑制多種刺激誘導的細胞凋亡。有研究[7]證明：HSP70可以通過以下途徑對細胞凋亡過程進行阻斷。

3.1 穩(wěn)定細胞內變性的蛋白質

在應激情況下，變性蛋白失去正常的三維結構，暴露出隱藏在內部有著與HSP70高度親和性的疏水性位點，HSP70作為主要的分子伴侶蛋白，與這些應激過程錯誤折疊或聚集的蛋白質結合，降低產生不溶性聚集物的危險性，加速受損傷蛋白質的再折疊，對應激細胞具有早期保護作用[8]。

3.2 阻止細胞色素c/caspase-9/Apaf-1凋亡體形成

從線粒體釋放的細胞色素C能與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,A-paf-1)和caspase-9形成凋亡體，誘導細胞凋亡。研究[9]發(fā)現(xiàn)，表達HSP70能抑制Caspase-3的活性，起到抗凋亡的作用。HSP70還能與腫瘤抑制蛋白PHAPI、凋亡易感蛋白CAS共同作用，加速Apaf-1的核苷交換，阻止無活性的Apaf-1/細胞色素C聚合，從而加速凋亡體的形成。

3.3 阻止凋亡誘導因子AIF從線粒體釋放及入核

AIF是位于線粒體內膜的黃素蛋白，在凋亡信號刺激時，AFI分子從線粒體釋放到胞漿，再通過其核定位信號轉位到細胞核中，直接引起染色體聚集、核呈大片段斷裂，導致細胞凋亡，這個過程是caspase非依賴的。研究發(fā)現(xiàn)AIF的150-228位氨基酸殘基與HSP70結合后，不能入核促使DNA片段化引起細胞凋亡，通過HSP70其ATP酶結構域和EEVD伴侶基序與AIF結合，并將從線粒體泄漏的AIF扣押在細胞質中，避免細胞凋亡[10]。

3.4 抑制應激活化蛋白激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)

活化蛋白激酶JNK是細胞凋亡信號傳導過程中關鍵性的應激激酶。在多種應激的情況下，活化的JNK可以通過磷酸化p53和Myc蛋白，或通過磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X促進細胞色素c自線粒體釋放，從而誘導細胞凋亡。而同樣獲得增強的HSP70通過阻斷信號通路，抑制應激誘導的SAPK/JNKs激活，阻斷JNK介導的細胞凋亡[11]；HSP70對JNK的活化抑制機制可能與清除異常蛋白在細胞內的積聚有關，與誘導型 HSP70的蛋白保護或再折疊作用機制不相關。

3.5 抑制凋亡基因P53、Bax的表達

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，上調HSP70表達能抑制P53和P53介導的細胞凋亡，并明顯減少Bax表達的上調，而對Bcl-2的表達無影響，HSP70可能通過抑制P53而防止P53介導的Bax基因的轉錄激活，但是，HSP70、P53和Bax之間的關系不完全清楚，還需要進一步研究。

4 HSP70與抑凋亡蛋白Bcl-2家族的關系

細胞凋亡區(qū)別于細胞壞死的一個顯著特征即受基因調控，Bcl-2基因是目前較為公認的與凋亡密切相關的基因家族。已在哺乳動物發(fā)現(xiàn)的Bcl-2基因蛋白家族由抑制凋亡的相關蛋白A1、Bcl-2、Bcl-X1、Mcl-1 等，及促進凋亡蛋白 Bak、Bax、Bid、Bik、BNIP3等組成。Bcl-2蛋白是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因[12]。Bcl-2蛋白調節(jié)細胞凋亡的機制是多種途徑的共同作用：1）Bcl-2和Bax的比例調節(jié)凋亡發(fā)生，Bcl-2和Bax既可以形成同源二聚體形式誘導凋亡，也可以形成異源二聚體“中和”凋亡[13]；2）定位于內質網膜的 Bcl-2，通過阻斷 Ca2+從內質網向胞質中的流動，降低核酸內切酶活性，從而阻斷細胞凋亡；3）Bcl-2抑制氧自由基的產生而發(fā)揮其抑制細胞凋亡的功能；4）對線粒體功能的保護作用:Bc1-2、Bc1-xl插入線粒體外膜，通過形成離子通道，幫助H+轉運出線粒體，從而維持線粒體完整性。Bax促進線粒體通透性轉換孔（PTP）開放，導致線粒體結構和功能的紊亂，釋放出caspase-9，誘導細胞凋亡[14]。

HSP70與Bcl-2有一些相似之處，如二者均在線粒體上有表達、均有抗氧化損傷作用、對一些凋亡因子引起的細胞凋亡均有抑制作用、對caspase-3有抑制作用等。經線粒體通路介導的凋亡信號其重要的特征是凋亡體的形成，HSP70可以通過阻斷細胞色素C的釋放，阻斷Apaf-1寡聚化及阻斷caspase-9的活化等多重環(huán)節(jié)阻斷凋亡體的形成[15]，對線粒體通路介導凋亡體形成的不同階段發(fā)揮阻斷作用。而且，在某些細胞凋亡中，二者有協(xié)同作用。

有研究表明，熱耐受既能誘導Bcl-2表達，也能誘導HSP70的表達；HSP70的過量表達也不會影響B(tài)cl-2的表達。盡管HSP70與Bcl-2的抗凋亡作用機制是否相同、二者關系如何，目前尚不清楚，但它的抗凋亡作用在許多方面得到了證實[16]。

5 HSP70抗心肌凋亡作用的研究現(xiàn)狀

近年來關于心肌保護的研究多注重于調動心臟內源性的保護機制，以提高心肌細胞自身耐受缺氧的能力。而HSP70已被證實是機體應激狀態(tài)下產生的一種重要的內源性保護因子。

心肌缺血再灌注可導致細胞的壞死和凋亡[17]，細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)之一。最近,A.Laubriet等[18]發(fā)現(xiàn)，HSP70和p53均在心肌缺血再灌注損傷過程中有明顯變化，而后者又是重要的細胞凋亡調控基因,HSP70與細胞凋亡的相關性很可能是通過 p53為中介的。H.Fliss等[19]采用原位末端標記法和瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)缺血及灌注期均可發(fā)生凋亡，但與缺血及灌注時相有關。F.Nomura等[20]發(fā)現(xiàn)，經熱休克預處理24 h后的綿羊在心肌缺血再灌注后,心室功能、內皮功能及有氧代謝的恢復明顯優(yōu)于對照組,誘導型HSP在熱休克15 min后即出現(xiàn),并持續(xù)到24 h后，提示HSP在心肌缺血后的自我保護作用中起著重要作用 。王喬等[21]用結扎左冠狀動脈前隆支法建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型，用免疫組織化學方法檢測HSP70表達，用TUNEL技術檢測心肌細胞凋亡。結果顯示，在急性心肌缺血再灌注損傷過程中，HSP70和細胞凋亡均呈現(xiàn)明顯地動態(tài)性表達并有著明顯的相關性；HSP70的代償性增加可能抑制細胞凋亡的發(fā)生；細胞凋亡的發(fā)生可能是誘發(fā)HSP70表達的一個重要機制。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，人們更加深入地研究了HSP70在心肌缺血/再灌注損傷中的保護作用。J.Jayakumar等[22]研究證明，采用 HSP70轉染的方法可以加強對心臟機械和內皮功能的保護；HSP70表達的代償性增加可能抑制心肌細胞凋亡從而成為心肌保護的一種理論依據(jù)。這與K.Suzuki等[23]的發(fā)現(xiàn)大體一致。K.Suzuki等[23]通過大鼠冠狀動脈內灌注日本脂質體血凝病毒基因轉染和在體外通過缺氧復氧誘導HSP70的過度表達，結果顯示：試驗組心臟自主復跳的時間、血清肌酸磷酸激酶水平、缺口末端標記法中心肌細胞陽性染色的百分率明顯少于對照組，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞DNA片段，試驗組明顯少于對照組，充分說明了 HSP70的過度表達減少了心肌細胞凋亡，發(fā)揮了對心肌細胞的保護作用。

J.Jayakumar等[22]通過轉染HSP70基因到大鼠心臟后發(fā)現(xiàn),轉基因大鼠心臟缺血再灌注后心功能恢復明顯優(yōu)于對照組，肌酸磷酸激酶漏出減少。提示HSP70的過度表達可能在心肌損傷中起著保護作用,HSP70基因轉染可通過增強自我保護作用而成為心肌保護的一種獨特的方式。

更多應激條件下的心肌凋亡蛋白的表達與HSP70表達的研究開始實施。池一凡等[24]建立langendorff離體心臟灌注模型，實驗組腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素，然后運用免疫組化測定心肌HSP 70、Bcl-2、Bax蛋白的含量，結果發(fā)現(xiàn)：實驗組 HSP70含量較對對照組明顯升高，Bcl-2的表達較對照組明顯增多，Bax的表達較對照組明顯減少，從而得出心肌HSP70高表達能促進心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，減少促凋亡蛋白Bax表達，增加Bcl-2/Bax概率，抑制心肌細胞凋亡。張偉華等[25]研究報道，利用體外培養(yǎng)大鼠、乳鼠心肌細胞同時溫度誘導細胞產生HSP70，H2O2造成心肌損傷，發(fā)現(xiàn)溫度誘導后HSP70在胞漿中大量表達，保護組凋亡率顯著低于損傷組，Bcl-2和Caspase-3在損傷組大量表達，提示HSP70可延遲細胞凋亡，對心肌細胞具有保護作用。

S.Okubo等[26]將單純載體、腺病毒·LacZ基因(Ad·LacZ)、腺病毒·HSP70(Ad·HSP70)基因分別轉移入兔的心肌中，然后經過30 min缺血和3 h再灌注 ,發(fā)現(xiàn) Ad·HSP70組的心肌梗死面積減少,而且這種保護作用僅表現(xiàn)在注射部位,在非注射部位沒有明顯的保護作用。充分說明了通過體內兔心肌HSP70基因轉移減少了 I/R心肌的梗死面積，HSP70的代償性增加是心肌損傷的一種重要自我保護作用。

總之，細胞凋亡不僅僅是心肌損傷的標志,可能也是通過加強某些應激蛋白的表達及其他途徑而產生對心肌的保護作用。作為分子伴侶的HSP70，它的表達不僅僅是心肌缺血再灌注損傷的標志，也起到通過抗氧化和抗凋亡等機制加強對心肌多方面的保護作用，這為臨床上尋求新的心肌保護途徑以及基因工程和藥物的治療開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。但具體的調控機制及如何利用該作用進行細胞保護，有待于深入研究。

［1］ Tissieres A,Mitchell H K,Tracy，U M.Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster:relation to chromosome puffs［J］.J Mol Biol,1974，84（3）:389-398.

［2］ Binder R J.Heat shock protein vaccines:from bench to bed side［J］.Int Rev Immunol,2006,25(526)：353-375.

［3］ 李萍，富春，熊凡.熱休克蛋白70及其在心肌保護中的作用［J］.醫(yī)學綜述，2004,10（2）：94-96.

［4］ 任寶淺,王五艷,王純凈,等.HSP70家族的分類及基因結構與功能［J］.動物醫(yī)學進展,2005,26(1):98-101.

［5］ 沈忠英.細胞凋亡研究進展［J］.中華病理學雜志,2000，29(1):63-65.

［6］ Gordon S A,Hoffman R A,Simmons R,et al.Induction of heat shock protein 70 protects thymocytes against radiationinduced apoptosis［J］.Arch Surg,1997,132(12):1277-1282.

［7］ Rokutan K.Role of heat shock proteins in gastric mucosal protection［J］.JGastroenterol Hepotol,2000,15（suppl）:D12-D19.

［8］ Su C Y,Chong K Y,Chen J.A physiologically relevant hyperthermia selectively activates constitutive hsp70 in H9c2 cardiac myoblasts and confers oxidative protection［J］.J Mol Cell Cardiol,1999,31(4):845-855.

［9］ 石永忠，肖衛(wèi)民，蔣碧梅，等.熱休克預處理抑制缺血-再灌注所致心肌細胞凋亡及機制［J］.中南大學學報：醫(yī)學版，2004,29（5）：509-512.

［10］ Ravagnan L,Gurbuxani S,Susin S A,et al.Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor［J］.Nat Cell Biol,2001,3(9):839-843.

［11］ Gbai V L,Meriin A B,Mosser D D,et al.Hsp70 presents activation of stress kinases.A novel pathway of cellular thermotolerance［J］.BiolChem,1997，272(29):18033-18037.

［12］ Hotman P.Molecular regulation of neutrophil apoptosis and potential targets for therapeutic strategy against the inflammatory process［J］.Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2004,3(1):1-9.

［13］ 彭黎明,王曾禮.細胞凋亡的基礎與臨床［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:126.

［14］ McDonnell J M,Fushman D,Miliman C L,et al.Solution structure of the proapoptotic molecule BID:a structural basis for apoptotic agonists and antagonists［J］.Cell,1999,96(3):625-634.

［15］ Saleh A,Srinivasula S M,Balkir L,et al.Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by HSP 70 ［J］.Nat Cell Biol,2000,2(8):476-483.

［16］ 李洪,劉橋義,楊天德.熱休克蛋白的抗凋亡作用［J］.國外醫(yī)學：臨床生物化學與檢驗學分冊，2002,21(3)：118-120.

［17］ 王國華，孫宗全，劉超，等.細胞外熱休克蛋白70在心肌缺血再灌注中對心肌細胞凋亡的作用［J］.華中醫(yī)學雜志,2007,31（3）：193-194.

［18］ Laubriet A,Fantini E,Assem M,et al.Changes in HSP70 and P53 expression are related to the pattern of electromechanical alterations in rat cardiomyocytes during simulated ischemia［J］.Mol Cell Biochem,2001,220(1/2):77-86.

［19］ Fliss H,Gaottinter D.Apoptosis in ischemic and reper fused rat myocardium［J］.Circ Res,1996,79(5):949-956.

［20］ Nomura F,Aoki M,Forbess J M,et al.Myocardial self preserveative effect of heat shock protein 70 on an immature lamb heart［J］.Ann Thorac Surg，1999,68(5):1736-1741.

［21］ 王喬，劉維新，徐明,等.心肌缺血再灌注損傷 HSP70表達與細胞凋亡動態(tài)觀察及相關性研究［J］.數(shù)理醫(yī)藥雜志,2003,16(6):503-504.

［22］ Jayakumar J，Suzuki K，Khan M，et al.Gene therapy formyocardial protection transfection of donor hearts with heatshock protein 70 gene protectacrdinc function agains ischem in reperfusion injury［J］.Circulation,2000,102(19):302-306.

［23］ Suzuki K,Sawa Y,Kagisaki K,et al.Reduction in myocardial apoptosis associated with over expression of heat shock protein 70［J］.Basic Res Cardiol,2000,95(5):397-403.

［24］ 池一凡,許慧,孫忠東,等.熱休克蛋白70對大鼠離體心臟細胞凋亡的影響［J］.中華實驗外科雜志,2009，26（6）:770-771.

［25］ 張偉華,張偉才,王麗娜,等.熱誘導延遲損傷大鼠心肌細胞凋亡機理的探討［J］.中國地方病學雜志,2003,22(4):292-294.

［26］ Okubo S,Wildner O,Shah M R,et al.Gene transfer of heat shock protein 70 reduces infarct size in vivo after ischemia reperfusion in the rabbit heart［J］.Circulation,2001,103(6):877-881.