李志群 祝 楊 李培建

對于一種新基因，同時把其編碼的新蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學功能、生物學和臨床醫(yī)學之間的相互關系、以及新基因表達調(diào)節(jié)的機制闡明，是目前基因的分子生物學研究領域中最具挑戰(zhàn)性的工作。首先利用酵母雙雜交（yeast two-hybrid）技術(shù)、酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid）、抑制性消減雜交（SSH，suppression subtractive hybridization）技術(shù)、基因芯片（DNA chip）技術(shù)、噬菌體表面展示（phage display）技術(shù)等獲得蛋白結(jié)合蛋白的編碼基因、差異表達的基因、DNA/RNA結(jié)合的蛋白基因等，或利用生物信息學技術(shù)獲得推測的編碼基因。然后，利用分子生物學技術(shù)和生物信息學技術(shù)相結(jié)合的手段，闡明新基因的功能、基因表達啟動子的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機制基礎，最終闡明新基因的結(jié)構(gòu)和新蛋白的生物學功能，以及這種基因研究的可能臨床醫(yī)學意義。生物信息學技術(shù)與分子生物學技術(shù)的結(jié)合，是目前基因的分子生物學研究領域中的重要、有效的研究技術(shù)和方法[1，2]。

一、蛋白質(zhì)組學研究的意義

蛋白質(zhì)組（proteome）最早見諸于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上[3]，它是指一個有機體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。蛋白質(zhì)組研究雖然尚處于初始階段，但已經(jīng)取得了一些重要進展。當前蛋白質(zhì)組學的主要內(nèi)容是，在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時，進行蛋白質(zhì)組分析。對蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個方面。一方面，通過二維凝膠電泳得到正常生理條件下的機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜，相關數(shù)據(jù)將作為待檢測機體、組織或細胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。二維參考圖譜建立的意義在于為進一步的分析工作提供基礎。蛋白質(zhì)組分析的另一方面，是比較分析在變化了的生理條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化[4]。如蛋白質(zhì)表達量的變化，翻譯后修飾的變化，或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細胞水平上的定位的改變等。研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)等。其中，酵母雙雜交系統(tǒng)是當前發(fā)展迅速、應用廣泛的主要方法。通過分析一個蛋白質(zhì)是否跟功能已知的蛋白質(zhì)相互作用可得到揭示其功能的線索。因為經(jīng)驗告訴我們，如果兩個蛋白質(zhì)相互作用，那么它們一般參與相同或相關的細胞活動[4]。從近期國際上蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)展動向可以看出，揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關系，建立相互作用關系的網(wǎng)絡圖，已成為揭示蛋白質(zhì)組復雜體系與蛋白質(zhì)功能模式的先導，業(yè)已成為蛋白質(zhì)組學領域的研究熱點。

二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）自建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強有力的方法之一。該方法在不斷完善，如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用，而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì)，在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關系網(wǎng)絡的認識上發(fā)揮了重要的作用。

雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，簡稱為DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點并激活轉(zhuǎn)錄[5]。

Fields等人的工作標志雙雜交系統(tǒng)的正式建立[6]。他們以與調(diào)控SUC2基因有關的兩個蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合，另外一個與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”（bait）和“獵物”或靶蛋白（prey or target protein）。如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用，那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因（reporter gene）。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因，并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因（Gal80是Gal4的負調(diào)控因子）被缺失，從而排除了細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達載體的酵母細胞才有β-半乳糖苷酶活性，單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。

在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細胞之間或α接合型細胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細胞，“誘餌”表達載體轉(zhuǎn)化a接合型細胞。然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔（lawn），再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過β-半乳糖苷酶活力進行鑒定[7]。

三、生物信息學技術(shù)與新基因的研究

新基因的克隆化無異是生物醫(yī)學領域創(chuàng)新知識源泉的重要組成部分。這一任務，不僅是人類基因組計劃（HGP）的核心內(nèi)容，同時也是后基因組計劃（post-HGP）的重要內(nèi)容.多年來，隨著以人的基因克隆化為主的不同生物類型基因克隆化研究的進展，已然積累了大量的不同生物的基因序列、蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列，同時對于不同生物種屬之間基因序列、蛋白質(zhì)以及結(jié)構(gòu)序列的保守結(jié)構(gòu)位點也積累了豐富的資料，并據(jù)此建立了龐大的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。對于這些數(shù)據(jù)的分析，必須依靠計算機分析技術(shù)。計算機分析技術(shù)的不斷發(fā)展，為這些資料和數(shù)據(jù)的分析建立了一些有效的分析技術(shù)。因此，自然而然就將基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的資料與計算機分析技術(shù)結(jié)合起來，形成了目前極具潛力的新興交叉學科-生物信息學（bioinformatics）技術(shù)。生物信息學技術(shù)的形成和發(fā)展，大大促進了以基因的分子生物學為核心內(nèi)容的現(xiàn)代生物醫(yī)學的發(fā)展，以基因的分子生物學為核心內(nèi)容的理論和技術(shù)，已經(jīng)成為生物學領域、醫(yī)學領域重要的創(chuàng)新知識源泉[8]。

四、生物信息學在蛋白質(zhì)研究中的應用

隨著后基因組時代的到來，闡明基因組所表達的全部蛋白質(zhì)的表達規(guī)律和生物功能，即蛋白質(zhì)組的研究，成為我們研究的最終目的，因為蛋白質(zhì)才是生命活動的真正執(zhí)行者[9]?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)研究方法，如雙向電泳等電聚焦、色譜分析、質(zhì)譜分析等，都需要特殊設備且價格昂貴；體外翻譯表達系統(tǒng)可研究蛋白質(zhì)的加工、釋放和亞細胞定位，但操作繁瑣，而生物信息學為我們提供了一條可以直接由基因或蛋白質(zhì)序列進行蛋白質(zhì)功能預測和結(jié)構(gòu)分析的捷徑。

生物信息學（bioinformatics）是生物與計算機科學以及應用數(shù)學學科相互交叉而形成的一門新興學科。它通過對生物學實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，達到解釋數(shù)據(jù)所蘊含的生物學意義的目的。

由于基因組和蛋白質(zhì)組研究提供了極為豐富的數(shù)據(jù)，因而需要我們對這些數(shù)據(jù)進行高度自動化管理，建立嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)庫并編寫相應的軟件，這項工作本身也極大地推動了生物信息學的發(fā)展，而生物信息學在蛋白質(zhì)的研究中將發(fā)揮特殊作用[10]。下面將介紹生物信息學技術(shù)在蛋白質(zhì)功能預測和結(jié)構(gòu)分析中的作用。

五、生物信息學發(fā)展趨勢

生物信息學內(nèi)涵非常豐富的學科，其核心是基因組信息學，包括基因組信息的獲取、處理、存儲、分配和解釋。它研究的是揭示基因組信息結(jié)構(gòu)的復雜性及遺傳語言的根本規(guī)律，解釋生命的遺傳語言。生物信息學已成為整個生命科學發(fā)展的重要組成部分，成為生命科學研究的前沿。隨著人類基因組計劃（Human Genomic Project，HGP）的完成和功能基因組計劃的實施，積累了大量的關于核苷酸、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，人們的注意力和工作重點已從基因組測序轉(zhuǎn)向?qū)蚪M表達、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的預測和分析。為了解釋和理解這樣大量的數(shù)據(jù)，自然地引進了信息科學與技術(shù)、物理、數(shù)學及計算機學科的理論與技術(shù)，從而出現(xiàn)了生物信息學這一嶄新的交叉學科。雖然獨立的生物信息學技術(shù)在世界各地廣泛運用，并已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)，但各種核苷酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的建立，以及因特網(wǎng)的聯(lián)系與數(shù)據(jù)庫資料的共享，代表了生物信息學的主流內(nèi)容和工具。生物信息學的逐漸形成和發(fā)展，對于生物醫(yī)學各個學科都產(chǎn)生了革命性的影響[8，11～15]。

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