沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 孫增明

關(guān)于微生物分子生物學(xué)的研究

沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 孫增明

一、微生物簡(jiǎn)介

微生物對(duì)人類最重要的影響之一是導(dǎo)致傳染病的流行。人類疾病中有50%是由病毒引起。世界衛(wèi)生組織公布資料顯示：傳染病的發(fā)病率和病死率在所有疾病中占據(jù)第一位。在疾病的預(yù)防和治療方面，人類取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是新現(xiàn)和再現(xiàn)的微生物感染還是不斷發(fā)生，大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療藥物,一些疾病的致病機(jī)制并不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強(qiáng)大的選擇壓力，使許多菌株發(fā)生變異，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，使人類健康受到新的威脅。一些分節(jié)段的病毒之間可以通過(guò)重組或重配發(fā)生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導(dǎo)致感染的株型發(fā)生了變異，這種快速的變異給疫苗的設(shè)計(jì)和治療造成了很大的障礙。而耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)使原本已近被控制住的結(jié)核感染又在世界范圍內(nèi)猖獗起來(lái)。

微生物千姿百態(tài)，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生不良變化。當(dāng)然，有些微生物是有益的，它們可用來(lái)生產(chǎn)如奶酪、面包、泡菜、啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過(guò)顯微鏡放大約1 000 倍才能看到。比如中等大小的細(xì)菌，1 000個(gè)疊加在一起只有句號(hào)那么大。想象一下一滴牛奶，每毫升腐敗的牛奶中約有5千萬(wàn)個(gè)細(xì)菌，或者講每夸脫牛奶中細(xì)菌總數(shù)約為50億。也就是一滴牛奶中可能含有50 億個(gè)細(xì)菌。

微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發(fā)霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青霉菌抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)中發(fā)現(xiàn)了青霉素，這對(duì)醫(yī)藥界來(lái)講是一個(gè)劃時(shí)代的發(fā)現(xiàn)。后來(lái)大量的抗生素從放線菌等的代謝產(chǎn)物中被篩選出來(lái)。抗生素的使用在第二次世界大戰(zhàn)中挽救了無(wú)數(shù)人的生命。一些微生物被廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵，生產(chǎn)乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，并且可再生潛力極大，稱為環(huán)保微生物；在極端環(huán)境例如高溫、低溫、高鹽、高堿以及高輻射等普通生命體不能生存的環(huán)境，依然存在著一部分微生物等等?？瓷先ィ呀?jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物已經(jīng)很多，但實(shí)際上由于培養(yǎng)方式等技術(shù)手段的限制，人類現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的微生物還只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

二.現(xiàn)代環(huán)境分子生物學(xué)研究方法

對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行分子生物學(xué)研究的方法主要有同源性分析法、梯度凝膠電泳方法、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等。

1. 16S rRNA同源性分析法。核蛋白體RNA(ribosomalRNA)是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA，約占RNA總量的80%以上，在蛋白質(zhì)翻譯中起著重要的作用。rRNA基因同源分析方法是目前研究的熱點(diǎn)，是多種分子生物學(xué)技術(shù)的組合，它通過(guò)對(duì)微生物的rRNA進(jìn)行分析，揭示微生物的多樣性，是分子微生物生態(tài)學(xué)的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括環(huán)境樣品的總DNA提取、探針及引物的設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、DGGE、TGGE、基因文庫(kù)的篩選、序列測(cè)定及分析、系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建和原位雜交等技術(shù)。PCR擴(kuò)增是分子生態(tài)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，可以在界、門(mén)、綱、目、科、屬甚至在種的水平上設(shè)計(jì)特異性引物，該引物核苷酸序列應(yīng)與待擴(kuò)增的微生物類群的rRNA全部匹配，但與其他類群的rRNA有錯(cuò)配或盡可能少。

2. 梯度電泳技術(shù)。DGGE技術(shù)通過(guò)指紋圖譜直接再現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)，避免了分離純化培養(yǎng)所造成的分析上的誤差，因此成為研究微生態(tài)的強(qiáng)有力工具。DGGE用于分析確定環(huán)境中微生物群體的遺傳多樣性、環(huán)境中微生物變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和微生物菌株的篩選，可避免對(duì)多個(gè)無(wú)遺傳差別或差別很小的菌株進(jìn)行繁瑣的各種表觀特征研究，近十年已被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生態(tài)研究中。

3. PCR擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)在結(jié)合其他技術(shù)如競(jìng)爭(zhēng)PCR、RAPD、AFLP、RFLP等的基礎(chǔ)上可對(duì)被擴(kuò)增序列作定性或定量分析，用于研究微生物群體結(jié)構(gòu)。

PCR-RFLP是將PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)結(jié)合用于檢測(cè)PCR降解基因在環(huán)境中的存在情況，當(dāng)將不同種細(xì)菌的DNA經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切時(shí)，內(nèi)切酶在其上的識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目和距離會(huì)發(fā)生改變，產(chǎn)生相當(dāng)多大小不等的DNA片段，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，由于遷移率不同形成不同的帶，因此可通過(guò)對(duì)酶切產(chǎn)物的分析，探測(cè)該基因的多態(tài)性，從而得到不同污染地區(qū)降解某物質(zhì)的微生物群落生物多樣性。

4. 核酸分子雜交技術(shù)。核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的分子生物學(xué)技術(shù)，是利用一段已知序列并帶有放射性同位素32P等標(biāo)記的多聚核苷酸作探針，檢測(cè)復(fù)雜的核酸分子混合物中是否存在與之互補(bǔ)目標(biāo)序列的技術(shù)。印跡轉(zhuǎn)移雜交是用放射性同位素探針與濾膜上的DNA或RNA分子雜交，經(jīng)顯影曝光顯示印跡。印跡轉(zhuǎn)移雜交分成兩種，一種是Southern印跡雜交，用于檢測(cè)DNA樣品；另一種是Northern印跡雜交，用于檢測(cè)RNA樣品。原位雜交法是將標(biāo)記的探針（如熒光標(biāo)記探針）加在組織切片（包括染色體）上，進(jìn)行顯微照相檢測(cè)目標(biāo)基因或目標(biāo)序列在染色體上的位置。在核酸原位雜交技術(shù)中，熒光原位雜交應(yīng)用較為廣泛。

分子生物學(xué)的發(fā)展揭示了生命本質(zhì)的高度有序性和一致性，是人類在認(rèn)識(shí)論上的重大飛躍?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究手段對(duì)于深入開(kāi)展微生物生態(tài)學(xué)研究具有日益重要的意義。同源性分析法、梯度凝膠電泳方法、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)作為代表性分子生物學(xué)分析方法，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但在未來(lái)現(xiàn)代微生物研究過(guò)程必將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。