肖 雯 ，聶福平 ，王 昱 ，肖進(jìn)文 ，李應(yīng)國(guó) ，劉 力

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶北碚 400715；2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶江北 400020；3.重慶進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶江北 400020）

山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）包括山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）和牛結(jié)節(jié)疹病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV），屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirdae），分別引起山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹，感染動(dòng)物表現(xiàn)為發(fā)熱，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性丘疹或結(jié)節(jié)，皮膚水腫，淋巴結(jié)腫大，消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的危害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙國(guó)際貿(mào)易[1-2]。山羊痘最早于公元前200年在歐洲發(fā)現(xiàn)，綿羊痘最早于13世紀(jì)在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，山羊痘和綿羊痘統(tǒng)稱羊痘，是動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種，發(fā)病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可達(dá)100%。世界各國(guó)均有羊痘發(fā)病和流行的相關(guān)報(bào)道，目前非洲北部、中東和亞洲的部分國(guó)家流行較為嚴(yán)重。羊痘病毒可作為生物武器，美國(guó)疾病控制中心（CDC）將其劃歸到Ⅱ類危險(xiǎn)病毒。此外，中國(guó)、印度、瑞典有人感染羊痘病毒的報(bào)道，因此羊痘在公共衛(wèi)生方面也有要意義[3]。牛結(jié)節(jié)疹于1929年在贊比亞首次發(fā)生，主要分布在非洲，發(fā)病率3%～85%，死亡率差異很大，一般為1%～2%，但在某些情況下可達(dá)20%～85%，近年來(lái)，隨著國(guó)際貿(mào)易的日益頻繁，該病在非洲以外地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將山羊痘、綿羊痘和牛結(jié)節(jié)疹列為法定通報(bào)傳染病，我國(guó)將山羊痘、綿羊痘列為一類動(dòng)物疫病[4]。

1 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1 電鏡觀察

CaPV是一種親上皮性的病毒，病畜的皮膚丘疹和結(jié)節(jié)、黏膜、血液、鼻腔分泌物、肺部病損組織和淋巴結(jié)內(nèi)存在大量病毒粒子，可作為病原分離培養(yǎng)的病料標(biāo)本，切片負(fù)染后，直接在透射電鏡下觀察病毒粒子進(jìn)行診斷。由于羊痘屬三種病毒形態(tài)相似，且與正痘病毒也很難區(qū)別，需要盡可能多觀察以確定病毒形態(tài)。該方法檢出率低，耗時(shí)長(zhǎng)，發(fā)病區(qū)往往無(wú)這樣的專業(yè)設(shè)備，難以滿足快速診斷的需要。

1.2 病毒培養(yǎng)

CaPV可在山羊、綿羊、牛的組織培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，原代或次代羔羊睪丸（LT）細(xì)胞和羔羊腎（LK）細(xì)胞最為敏感，尤其是毛用綿羊細(xì)胞，也可在某些傳代細(xì)胞系中增殖，如BHK-21、Vero-E6細(xì)胞等[5]。周碧君等[6]研究表明，組織病料對(duì)Vero-E6細(xì)胞的適應(yīng)性比對(duì)BHK-21細(xì)胞要好，前者可用于臨床組織樣本中羊痘病毒的初次分離。病毒接種后24 h出現(xiàn)細(xì)胞病變，3 d后整個(gè)細(xì)胞單層出現(xiàn)病變，特征為細(xì)胞膜收縮并與周圍細(xì)胞分離，圓化，染色質(zhì)貼近細(xì)胞膜。病毒分離培養(yǎng)特異性較高，但耗時(shí)、費(fèi)力，需要較高的專業(yè)知識(shí)和技能，因而在應(yīng)用上受到限制。

2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 中和試驗(yàn)（neutralization test，NT）

機(jī)體感染CaPV后主要產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，因此該方法敏感性不高[7]。但是，感染病毒后痊愈的動(dòng)物在其血清中可檢測(cè)到較高水平的中和抗體。

2.2 熒光抗體試驗(yàn)（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT）

山羊痘病毒抗原可在感染的組織培養(yǎng)破片上進(jìn)行FAT來(lái)鑒定，但該方法操作繁瑣，有非特異性反應(yīng)的問(wèn)題，難以推廣[7]。

2.3 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID最早應(yīng)用于60年代，可用于羊痘病毒沉淀抗原的檢測(cè)，后來(lái)利用甲硫氨酸對(duì)山羊痘抗原進(jìn)行標(biāo)記，極大地提高了對(duì)山羊痘抗體的檢測(cè)敏感性。AGID操作簡(jiǎn)單、需要設(shè)備少、價(jià)格便宜等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但其敏感性相對(duì)較低，適于基層獸醫(yī)開(kāi)展山羊痘病例的診斷[8]。

2.4 對(duì)流免疫電泳（counter immune electrophoresis，CIE）

CIE是一種常用的檢測(cè)抗原或抗體的方法，1988年首次用于檢測(cè)羊痘病毒抗體，結(jié)果顯示用滅活的抗原與抗體具有同等的敏感性，與AGP相比，其檢出率更高。1999年，Joshi等用生理鹽水溶液替代巴比妥緩沖液，改進(jìn)的后CIE與常規(guī)CIE相比，可提高檢測(cè)的靈敏度。周碧君等[9]研究發(fā)現(xiàn)CIE能提高對(duì)抗原或抗體的分辨能力，較AGID敏感且速度快。該方法比較簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但需要一定的設(shè)備。

2.5 間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination assay，IHA）

CaPV本身不能凝集紅細(xì)胞，因此利用致敏的綿羊紅細(xì)胞進(jìn)行間接凝集實(shí)驗(yàn)非常有用，如反向被動(dòng)血 凝 試 驗(yàn)（reversed passive hemagglutination assay，RPHA）主要用于臨床痘疹痂皮和感染細(xì)胞中GPV抗原的定量測(cè)定。IHA用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)CaPV比AGIDT和CIE更敏感。在各種類型的致敏紅細(xì)胞中，用戊二醛與鞣酸致敏可大大提高檢測(cè)的靈敏度，在綿羊痘的診斷中效果較好[10]。

2.6 乳膠凝集試驗(yàn)（latex agglutination test，LAT）

LAT在多種抗體、抗原檢測(cè)系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用，是一種不需要昂貴的設(shè)備，操作簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法，特別適合在田間和農(nóng)場(chǎng)使用。1996年，Rao等首次建立了檢測(cè)羊痘的乳膠凝集試驗(yàn)，其敏感性可與CIE相當(dāng)。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）

ELISA操作便利、快速、敏感、特異性強(qiáng)，便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。國(guó)外已建立了多種檢測(cè)CaPV抗原或抗體的ELISA方法。Carn[11]建立了用于檢測(cè)從山羊、綿羊、牛的活組織樣品中分離的羊痘病毒的抗原捕捉ELISA方法，適合于組織培養(yǎng)物中的病毒檢測(cè)。1997年Rao等[12]建立了用于檢測(cè)皮膚活組織中的GPV抗原的免疫捕捉IC-ELISA方法，特異性80%～100%，敏感性70%～86%，該法不能與綿羊痘區(qū)別診斷。1999年Rao等[13]建立了用于檢測(cè)GPV抗體的Avidin-biotin（抗生素蛋白-生物素）ELISA方法，特異性為91.8%，敏感性為94.1%。然而，目前國(guó)內(nèi)外還暫無(wú)牛結(jié)節(jié)疹ELISA檢測(cè)方法報(bào)道。

P32蛋白抗原在ELISA中反應(yīng)性好，靈敏度、特異性較AGID高，可進(jìn)行批量樣品的檢測(cè)，與國(guó)際通用的NT比較，有與其他痘病毒也無(wú)交叉反應(yīng)、不需要組織培養(yǎng)條件、檢測(cè)樣本量大、便于推廣等優(yōu)點(diǎn)[11-14]，但是，其跨膜區(qū)對(duì)細(xì)胞有毒性，使其表達(dá)量較低，重組P32蛋白很難純化[15]，而截取跨膜區(qū)會(huì)對(duì)P32蛋白免疫原性有一定影響[16]，因而推廣受到限制。目前，P32蛋白的體外表達(dá)已成為國(guó)際上羊痘研究的熱點(diǎn)[17-23]。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法的日益成熟，該技術(shù)已廣泛用于病毒的分類、鑒定和疾病診斷。CaPV屬于雙股DNA病毒，更適于PCR檢測(cè)[16，23-25]。已報(bào)到的羊痘病毒PCR檢測(cè)方法中，引物多根據(jù)編碼羊痘衣殼蛋白P32和反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat，ITR）設(shè)計(jì)。國(guó)外Ireland[24]和Heine等[26]根據(jù)P32基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，建立了檢測(cè)皮膚樣品中羊痘病毒的PCR方法，并利用限制性內(nèi)切酶做了進(jìn)一步的確診。Markoulatos等[25]針對(duì)SPV的ITR和α微管蛋白基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物，建立了用于檢測(cè)皮膚組織中SPV的多重PCR技術(shù)，該方法敏感性和特異性較好，但偶爾會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Hosamani等[27]依據(jù)GPV和SPV的P32基因序列的差異，建立了區(qū)分山羊痘和綿羊痘的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法。在國(guó)內(nèi)，郭巍等[28]根據(jù)P32基因和α微管蛋白基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了山羊痘的診斷方法，擴(kuò)增出P32基因序列與Genbank上收錄的序列同源性達(dá)98%?？滴挠竦萚29]依據(jù)羊痘 P32基因序列，建立了快速、特異、敏感、可定量、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。韓若嬋等[30]根據(jù)P32基因和ITR設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立的多重PCR方法。Stram Y[31]等通過(guò)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析羊痘病毒基因組末端466 bp片段，建立的半巢式PCR方法，分別與綿羊痘病毒、羊口瘡病毒和牛皰疹病毒進(jìn)行PCR比對(duì)檢測(cè)，該方法檢測(cè)羊痘病毒的特異性高。

此外，還有針對(duì)CaPV其他基因建立PCR方法的研究。如Mangana Vougiouk等[32]基于山羊痘病毒的KS-1和Ins-1基因序列設(shè)計(jì)引物鑒定了6株在細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)的SPV，能將其與接觸傳染性膿皰皮炎病毒和皰疹病毒區(qū)分開(kāi)。程振濤等[33]針對(duì)山羊痘病毒基因組gp064區(qū)域約64 bp的基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物和一條TaqMan-MGB探針，建立了FQPCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該方法對(duì)山羊痘臨床皮膚痘疹材料和人工感染動(dòng)物材料進(jìn)行GaPV核酸檢測(cè)，為山羊痘臨床快速高效地診斷和山羊痘病毒感染羊只的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸研究提供了一種有效的手段。Lamien等[34]根據(jù)G蛋白耦聯(lián)趨化因子受體基因建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法，能對(duì)羊痘病毒屬進(jìn)行種屬鑒別、定量分析和基因分型。目前還沒(méi)有基因芯片技術(shù)應(yīng)用于羊痘病毒檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

4 Western印跡

Western免疫印跡是以山羊痘病毒感染的細(xì)胞裂解物檢查血清樣本中病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體，敏感性和特異性較高，但該方法操作困難、價(jià)格昂貴[35]。羊傳染性結(jié)節(jié)口炎病毒高免血清可與一些山羊痘病毒蛋白反應(yīng)，但不與P32蛋白反應(yīng)。

5 展望

近年來(lái)，我國(guó)新疆、甘肅、寧夏、青海、陜西、福建、貴州等地頻繁地發(fā)生山羊痘和綿羊痘疫情，嚴(yán)重影響國(guó)內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。我國(guó)尚無(wú)確切的牛結(jié)節(jié)疹相關(guān)報(bào)道，但隨著國(guó)際貿(mào)易日益頻繁，近年來(lái)該病流行范圍有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)。為了降低羊痘帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失、公共衛(wèi)生安全問(wèn)題和嚴(yán)格防止牛結(jié)節(jié)疹的傳入，建立快速高效、操作簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)方法具有重要意義。羊痘病毒屬間及其與正痘病毒和副痘病毒有相似的血清型，血清學(xué)方法難以診斷。分子生物學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度、特異性和時(shí)效性等優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，進(jìn)一步研究CaPV基因組特異性強(qiáng)的序列、表達(dá)量高的功能基因序列，或一些重要的編碼功能的基因，將會(huì)為羊痘病毒屬的鑒別診斷、預(yù)防與控制、流行病學(xué)等開(kāi)辟新的領(lǐng)域。

[1]Tsotsos．A developments in taxonomy of viruses[J]．Hellenic Virol，1996，1（2）：175-183．

[2]殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)[M]．2 版．北京：科學(xué)出版社，1997：939-963．

[3]洪艷，謝忠文，施恒豫．人感染山羊痘5例[J]．中華傳染病雜志，2005，23（2）：143．

[4]王開(kāi)功，虞天德，張大權(quán)，等．貴州省首次暴發(fā)山羊痘的診斷研究 [J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（4）：116-118．

[5]Baiuks P，Copps J．Evaluation of an ovine testis cell line （OA3.Ts）for propagation of capripoxvirus isolates and development of an immunostaining technique for viral plaque visualization[J]．J Vet Diagn Invest，2007，19（5）：486-491．

[6]周碧君，虞娟，徐春志，等．貴州省山羊痘病例的病原學(xué)鑒定與病理學(xué)觀察[J]．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（5）：382-385.

[7]劉勝利，黃冠勝，趙增連，等．動(dòng)物蟲(chóng)媒病與檢驗(yàn)檢疫技術(shù)[M]．北京：科學(xué)出版社，2011：278-279．

[8]Kitehing R P，Hammond J M．Studies on the major common precipitating antigen of capripoxvirus[J].Virol，1986，67（Pt1）：139-148．

[9]周碧君，馮元璋，許樂(lè)仁．山羊痘血清學(xué)診斷技術(shù)研究[J]．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（4）：423-426．

[10]Rao T V，Negi B S，Bansal M P．Use of Purif i ed soluble antigens of sheep poxvirus in serodiagnosis[J].Indian Journal of animal sienees，1997，67（8）：642-645．

[11]Carn V M，Kitching R P，Hammond J M，et al．Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripox virus[J]．J Virol Methods，1994，49（3）：285-294．

[12]Rao T V，Nandi S．Evaluation of immunocapture ELISA for diagnosis of goat pox[J]．Acta Virological，1997，41（6）：345-348．

[13]Rao T V，Bandy Dpadhyay S K．A comprehensive review of goat pox and sheep pox and their diagnosis[J].Animal Health Research Review，2000，1（2）：l27-l36．

[14]Hdine H G，Stevens M P，F(xiàn)oord A J，et al. A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32，the homolog of the vaccinia virus H3L gene[J]．Immunol Methods，1999，227（1/2）：187-196．

[15]陳軼霞，鄭亞?wèn)|，竇永喜，等．羊痘病毒P32蛋白基因的克隆與原核表達(dá)[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（1）：31-34．

[16]陳軼霞，才學(xué)鵬，景志忠，等．羊痘病毒P32基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫原性[J]．病毒學(xué)報(bào)，2008，24（2）：133-137．

[17]TulIman E R．The Genomes of Sheeppox and Goatpox Viruses[J]．Virol，2002，76（12）：6054-6061．

[18]Kitching R P．Studies on the Major Common Precipitation Antigen of Capripoxvirus[J]．gen Virol，1986，67（Pt1）：139-148．

[19]Paul D Gershon．A Comparison of the Genomes of Capripoxvirus Isolates of Sheep，Goat and cattle[J]．Virology，1988，164（2）：341-349．

[20]Chand P．Kitch ing R P，Black D N．Wstern blot analysis of virus specific antibody for capripox and contagious pustular dermatitis viral infection in sheep[J].Epidenmiol Infect，1994，113（2）：377-385．

[21]Heine H G， Stevens M P．A capripoxvirus detection PCR andantibody ELISA based on the major P32，the homolog of the vaccinia virus H3L gene[J]．J Immunol Methods，1999，227（1/2）：187-196．

[22]Carn V M，Kitching R P，Hammond J M，et al．Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecing bovine antibody to capripoxvirus[J]．J Virol Methods，1995，53（2/3）：273．

[23]Magana V O．Sheep poxvirus identification from clinical specimens by PCR，cell culture，immunof l uorescence and agar gel immmunoprecipitation assay[J]．Mol Cell Probes，2000，14（5）：305-310．

[24]Ireland D C，Binepal Y S．Improved detection of capripoxvirus in biopsy samples by PCR[J]．J Virol Methods，1998，74（1），1-7．

[25]Markoulatos P，Vougiouka O M，Koptopoulos G，et al．Detection of sheep poxvirus in skin biopsy sample by a multiplex polymerase chain reaction[J]．Virological Methods，2000，84（2）：161-167．

[26]Heine H G，Stevens M P，F(xiàn)oord A J，et al.A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32，the homolog of the vaccinia virus H3L gene[J]．J Immunol Methods，1999，227（1/2）：187-196．

[27]Mondalb H，Prabhakar A.Differentiation of sheep pox and goat poxvirus by sequence analysis and PCR-RFLP of P32 gene[J]．Virus Genes，2004，29（1）：73-80．

[28]郭巍，陳杰，黃保續(xù)，等．應(yīng)用PCR檢測(cè)山羊痘病毒[J]．中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33（12）：50-52．

[29]康文玉，徐自忠，花群義，等．羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量TaqManPCR檢測(cè)方法的建立[J]．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（7）：529-533．

[30]韓若禪，張強(qiáng)，吳國(guó)華，等．羊痘病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立 [J]．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（3）：206-208．

[31]Stram Y，Kuznetzova L，F(xiàn)riedgut O，et al.The use of lumpy skin disease virus genome termini for detection and phylogenetic analysis[J]．J Virol Methods，2008，151（2）：225-229．

[32]Mangana-Vougiouka O，Markoulatos P，Koptopoulos G，et a1．Sheep poxvirus identif i cation by PCR in cell cultures [J]．Journal of Virological Methods，1999，77（1）：75-79．

[33]程振濤，岳筠，李永明，等．山羊痘病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]．生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（3）：464-472．

[34]Lamien C E．Real time PCR method for simultaneous detection，quantitation and differentiation of capripoxviruses[J]．Journal of Virological Methods，2010，171（1）：134-140．

[35]Chand P，Kitching R P，Black D N．Western bolt analysis of virus-specif i c antibody responses for cappripox and contagious pustule dermatitis viral infections in sheep[J]．Epidemiol Infect，1994，113（2）：377-385．