潘 旋 王朝霞

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210011

生長(zhǎng)抑制因子蛋白家族（inhibitor of growth family，ING）是一組重要的腫瘤抑制因子，有INGl～I(xiàn)NG5這5個(gè)家族成員，這五種基因共編碼包括INGl基因的3種產(chǎn)物（INGla、INGlb、INGlc）以及ING基因家族其它4個(gè)成員的編碼蛋白[1-3]的7種蛋白。ING4作為一種新的候選抑癌基因，近年來它的抑癌功能及其機(jī)制受到越來越多的關(guān)注，本研究就ING4基因與腫瘤的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ING4基因

ING4最初于2002年從人的腦垂體中被分離出[4]，其編碼的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，在人類所有被檢測(cè)到的組織中均有表達(dá)[5]。該基因跨度為13 kb，定位于人類染色體12p13.31，至少包含8個(gè)外顯子，Genebank中有兩個(gè)不同一個(gè)編碼248個(gè)氨基酸的mRNA轉(zhuǎn)錄本，編碼249個(gè)氨基酸的mRNA轉(zhuǎn)錄本，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的不同可能是由于ING4的不同剪切方式而形成的，一個(gè)在131-132位氨基酸為K（賴氨酸）、G（甘氨酸），另一個(gè)在131-132位合并為一個(gè)S（絲氨酸）[6]。ING4蛋白與ING家族其他成員在N端和C端上具有高度的同源性。它的C端有一個(gè)植物同源結(jié)構(gòu)域（planthomeodomain，PHD）[7]，此結(jié)構(gòu)域是磷脂酰肌醇磷酸的核受體功能結(jié)構(gòu)域，通過與磷脂酰肌醇磷酸信號(hào)分子相結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)與增殖[1-2，8]。N端是一個(gè)核定位信號(hào)序列（nuclear localization sequence，NLS），此結(jié)構(gòu)在幫助ING4蛋白的核定位以及與p53在細(xì)胞核的復(fù)合定位中起著重要的作用[9-10]。

2 ING4基因異常與腫瘤的發(fā)生

2.1 ING4基因表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生

Garkavtsev I等[5]采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，惡性程度低的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中ING4 mRNA的表達(dá)水平較正常腦組織低2～3倍，而高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中ING4 mRNA的表達(dá)水平較正常腦組織低6倍。另外，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)到膠質(zhì)瘤中ING4蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常腦組織，而且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，ING4的表達(dá)水平也相應(yīng)降低。曹芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織與良性乳腺增生組織中ING4蛋白表達(dá)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明ING4蛋白表達(dá)缺失與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。Wang等[12]通過檢測(cè)50例肺癌組織中ING4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ING4在肺癌組織中較癌旁正常肺組織顯著低表達(dá)，且ING4的表達(dá)水平與肺癌的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況負(fù)相關(guān)，推測(cè)ING4的下調(diào)與肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

microRNA（miRNA）可通過和靶mRNA的3’非編碼區(qū)（UTRs）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)ING4基因是miR-650下游直接的靶基因，miR-650的表達(dá)在胃癌組織中顯著上調(diào)，而ING4則顯著下調(diào)，由此筆者推測(cè)，過表達(dá)miR-650促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖可能是通過靶向抑制抑癌基因ING4實(shí)現(xiàn)的。Li等[13]運(yùn)用組織芯片的技術(shù)分析101例原發(fā)性黑色素瘤活檢組織，結(jié)果顯示，ING4基因在惡性黑色素瘤中的表達(dá)水平明顯低于發(fā)育異常的痣，ING4的表達(dá)水平與黑色素瘤的厚度、潰瘍形成密切相關(guān)，是預(yù)后差的分子標(biāo)志物之一。ING4基因在頭頸部鱗癌中表達(dá)也顯著下降，且與頭頸部鱗癌的低分化狀態(tài)、TNM分期負(fù)相關(guān)[14-15]。

2.2 ING4基因突變與腫瘤的發(fā)生

Gunduz M等[15]采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，在9個(gè)腫瘤細(xì)胞株中，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（IMR-32、SK-N-AS、SKN-BE）、非小細(xì)胞癌細(xì)胞株（H23）、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（H82）、乳腺癌細(xì)胞株（T47D）和結(jié)直腸癌細(xì)胞株（ACHN）7個(gè)ING4基因發(fā)生了突變。12個(gè)核苷酸的缺失是最普遍的突變，包括一組NLS其編碼序的列。SK-N-AS細(xì)胞株發(fā)生單核苷酸465C缺失，H82細(xì)胞株單核苷酸446A缺失，缺失的結(jié)果導(dǎo)致移碼突變，產(chǎn)生截短的基因產(chǎn)物，在近一半的缺失中包含PHD區(qū)，這兩種單核苷酸缺失變異不僅產(chǎn)生無功能的蛋白，并且使野生型等位基因產(chǎn)生的正常的ING4蛋白受到抑制。另外，ING4基因的突變還有包括H82和ACHN細(xì)胞株在內(nèi)的錯(cuò)義突變。而Gundus等[15]采用RT-PCR和cDNA測(cè)序法分析50例頭頸部鱗癌標(biāo)本中ING4基因的突變情況，沒有發(fā)現(xiàn)任何變異。

3 ING4基因的作用機(jī)制

3.1 增強(qiáng)p53基因的活性

組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合物（HAT）在氨基酸殘基乙酰化中起重要作用，P300為其中的一個(gè)成份，ING4與P300亞基相結(jié)合是Shiseki M等[1]通過免疫共沉淀反應(yīng)發(fā)現(xiàn)的。因此，ING4基因可以通過控制p53乙酰化狀態(tài)來調(diào)節(jié)p53的功能，使p53的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，腫瘤的發(fā)生即被抑制。ING4定位于細(xì)胞核內(nèi)是通過核定位信號(hào)（NLS）與p53結(jié)合來完成的，當(dāng)NLS區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，ING4不能與p53蛋白結(jié)合，從而不能夠上調(diào)p53蛋白活性發(fā)揮抑制腫瘤的功能[10]。

3.2 恢復(fù)細(xì)胞間接觸抑制

Kim等[15]等研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)ING4可抑制由原癌基因MYC或MYCN過度表達(dá)引起的細(xì)胞間接觸抑制的喪失，在腫瘤細(xì)胞株中，ING4突變可使其接觸抑制的功能失活，ING4影響MYC下游靶基因的轉(zhuǎn)錄被認(rèn)為是可能的作用機(jī)制，因?yàn)樵贛YC誘導(dǎo)的接觸抑制喪失中靶基因起直接作用。

3.3 抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

腫瘤惡變的重要因素之一是血管增生，而腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移卻要依賴新生血管形成。在Garkavtsev I等[5]的研究中，在小鼠大腦中分別植入ING4基因表達(dá)量高與低的人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞株，用活體顯微鏡觀察小鼠大腦中血管的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入ING4基因低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株后，與對(duì)照組相比，血管數(shù)量和血管密度均比較高，出血更頻繁，且腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)更快。這些結(jié)果均說明ING4能抑制血管的生成進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

Li J等[13]發(fā)現(xiàn)ING4基因過表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞中張力絲的形成減少，MMP-9、MMP-12的活性下降，過表達(dá)ING4基因能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。在后續(xù)的研究中，Li等[18]又發(fā)現(xiàn)ING4通過抑制NF-кB/IL-6通路影響黑色素瘤新生血管的形成，并且ING4基因是轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1下游的靶基因，BRMS1可能通過ING4基因發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ING4基因能夠與核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）結(jié)合，抑制NF-κB調(diào)節(jié)基因如 IL-8、MMP-9、COX-2 等的轉(zhuǎn)錄[5，16]。這些基因在腫瘤新生血管的生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要的作用。ING4對(duì)這些因子的轉(zhuǎn)錄抑制并不是通過直接阻礙NF-κB活化，細(xì)胞核定位以及與DNA的結(jié)合，相反，ING4與NF-κB蛋白同時(shí)結(jié)合到這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域，出現(xiàn)p65亞基磷酸化、HAT中p300亞基和乙?；M蛋白的下降，進(jìn)而上調(diào)此啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶（HDAC）的活性來抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。另外，Klironomos等[20]運(yùn)用免疫組化的方法分析101例星形細(xì)胞瘤中ING4、NF-κB的表達(dá)水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)ING4與p65的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此ING4可能通過影響IL-8、MMP-9、COX-2的表達(dá)抑制腫瘤血管的生成及腫瘤生長(zhǎng)。

3.4 ING4抑制HIF的活性

低氧誘導(dǎo)因子 -1（hypoxia—inducible factor-1，HIF-1）目的基因中包含許多與葡萄糖代謝和糖酵解相關(guān)的酶，它調(diào)控著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及糖酵解酶等[17]。在缺氧狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞通過HIF上調(diào)這些酶的表達(dá)，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)[18]。低氧時(shí)HIF的上調(diào)是腫瘤生長(zhǎng)過程中重要的促進(jìn)因素，所以抑制HIF的活性可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，提高腫瘤治療的療效。Ozer等[19]研究證實(shí)ING4能與低氧誘導(dǎo)因子（HIF）脯氨酰羥化酶的鐵依賴性氧化酶直接發(fā)生作用，通過ING4的募集反應(yīng)來調(diào)節(jié)HIF的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ING4能夠明顯抑制缺氧狀態(tài)下HIF靶基因（如Nip3、AK3等）的表達(dá)。

3.5 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

Shiseki M等[1]在結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株中高表達(dá)ING4基因，發(fā)現(xiàn)：RKO細(xì)胞克隆形成能力下降，S期細(xì)胞數(shù)量的減少以及G0/S和G2/M期細(xì)胞數(shù)量的增加，p53下游p21蛋白表達(dá)增加，并且這一過程是p53依賴的。而Zhang等[20]研究顯示，ING4誘導(dǎo)的p2l的上調(diào)可以增強(qiáng)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Bl（cyclin B1）和p2l的結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞G2/M周期阻滯，最終抑制細(xì)胞的增殖，且這種抑制呈劑量依賴性。此外，在胰腺癌中也觀察到此類現(xiàn)象，ING4過表達(dá)誘導(dǎo)S期細(xì)胞比例下降，G2/M期細(xì)胞數(shù)上升[21]。這些結(jié)果表明ING4可能通過p53依賴的方式，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但Kim等[15]則認(rèn)為ING4對(duì)細(xì)胞增殖沒有直接的抑制作用，而是通過恢復(fù)細(xì)胞間的接觸抑制，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

MicroRNA（miRNA）可通過和靶mRNA的3’非編碼區(qū)（UTRs）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移[26]。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)ING4基因是miR-650下游直接的靶基因，miR-650的表達(dá)在胃癌組織中顯著上調(diào)，而ING4則顯著下調(diào)，由此我們推測(cè)，過表達(dá)miR-650可能是通過靶向抑制ING4基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

3.6 ING4基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性

Klironomos G等[20]用外源性ING4基因感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，并用細(xì)胞毒藥物阿霉素和鬼臼乙叉甙處理HepG2細(xì)胞，通過檢測(cè)亞G1期細(xì)胞凋亡數(shù)來評(píng)價(jià)ING4基因化療增敏作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ING4能提高HepG2細(xì)胞對(duì)阿霉素、鬼臼乙叉甙的化療敏感性，并呈現(xiàn)劑量依賴方式。阿霉素治療組（阿霉素+ING4）較對(duì)照組（阿、霉素）敏感性提高3倍，鬼臼乙叉甙治療組（鬼臼乙叉甙+ING4）較對(duì)照組（鬼臼乙叉甙）敏感性提高4～4.6倍。Xie等[22]則證實(shí)ING4能夠提高肝癌細(xì)胞株SMMC-7721對(duì)抗癌藥順鉑的敏感性，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)ING4基因影響內(nèi)源性和外源性凋亡通路中的重要因子，如Fas、Bcl-2、Bax、caspase-3等，這些研究為肝癌的聯(lián)合治療方案提供了新的理論依據(jù)。田玥等[23]還發(fā)現(xiàn)ING4能增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)持續(xù)低劑量率γ射線的敏感性，兩者聯(lián)合應(yīng)用后胰腺癌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，生長(zhǎng)明顯抑制。

Zhang等[30]首次證實(shí)miR-214和miR-15在胰腺癌組織中異常高表達(dá)，過表達(dá)miR-214可降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥吉西他濱的敏感性，并且ING4基因是miR-214的一個(gè)靶基因，miR-214靶向抑制ING4的表達(dá)可能介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的下降。

綜上所述，ING4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，能抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加腫瘤的放化療敏感性，是一種新的重要腫瘤抑癌基因，隨著對(duì)ING4基因研究的不斷深入，將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)ING4的生物學(xué)功能及其對(duì)腫瘤的調(diào)控機(jī)制，為腫瘤的基因治療及分子靶向治療提供新的依據(jù)及靶標(biāo)。

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