吳勁松 浙江省湖州市南潯人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 湖州 313000

艱難梭菌（clostridium difficile，CD）又稱難辨梭狀芽孢桿菌，是一種厭氧革蘭染色陽(yáng)性芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境及動(dòng)物和人的糞便中，主要通過(guò)糞-口途徑傳播[1-2]。艱難梭菌是引起醫(yī)源性腹瀉的重要病原菌，與大量抗生素使用有關(guān)，其感染典型表現(xiàn)是偽膜性腸炎[3-4]。目前全球特別是歐洲和北美艱難梭菌感染的流行暴發(fā)迅速增多，嚴(yán)重病例數(shù)、復(fù)發(fā)率和病死率均明顯上升，耐藥菌株也在增多，給該病的臨床診斷和治療提出新的挑戰(zhàn)[5]，因此臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)其快速而準(zhǔn)確的識(shí)別、鑒定具有重要意義。筆者采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)艱難梭菌進(jìn)行快速檢測(cè)鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌 株 艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC9689）及其它引起腹瀉致病菌如福氏志賀菌ATCC51311，空腸彎曲菌ATCC33560，產(chǎn)單核李斯特菌ATCC7644，霍亂弧菌ATCC16026，腸出血性大腸埃希菌O157：H7 ATCC43889，沙門菌 ATCC50041／ATCC14028，副溶血性弧菌ATCC20506。均購(gòu)于中國(guó)微生物菌種庫(kù)。

1.2 糞便標(biāo)本 278例糞便標(biāo)本均來(lái)自我院2010年1月—2010年12月住院腹瀉患者，所有標(biāo)本采集后均保存于4℃，并在4h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3 艱難梭菌毒素檢測(cè) 采用法國(guó)生物梅里埃公司的VIDAS難辨梭菌毒素檢測(cè)試劑對(duì)上述糞便標(biāo)本艱難梭菌感染情況進(jìn)行分析。

1.4 基因組DNA提取 菌株基因組DNA提取采用Promega公司W(wǎng)izardGenomic DNA Purification Kit試劑盒，糞便基因組提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA stool Mini Kit試劑盒，按照操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 熒光定量PCR 根據(jù)艱難梭菌TcdB基因序列采用Primer Express3.0軟件（ABI）設(shè)計(jì)特異性引物和探針，上游引物：5’-GAAAGTCCAAGTTTACGCTCAAT-3’；下游引物：5’-GCTGCACCTAAACTTACACCA-3’；熒光探針：5’-FAM-ACAGATGCAGCC AAAGTTGTTGAATT-TAMRA-3’。按照以下體系配制反應(yīng)液：5.0μL10×PCR buffer，7.0μL 25mM Mg2+，4.0μL 2.5mM dNTP，10μM 上下游引物各 2.0μL，10μM 熒光探針 0.5μL，5U/μL Taq 酶 1.0μL，模板DNA 5.0μL，雙蒸水補(bǔ)足 50μL；在 ABI7000 熒光定量 PCR 儀上按照 94℃變性 5min，94℃15s、60℃60s的循環(huán)條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后觀察分析結(jié)果。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pGEM-T載體上，并轉(zhuǎn)化至JM-109感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，以上游引物和下游引物進(jìn)行PCR篩選挑取陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒采用質(zhì)粒DNA提取試劑盒（OMEGA）提取。用紫外分光光度計(jì)定量后，用含10ng/mL鮭魚精DNA的1×TE（pH8.0）連續(xù) 10 倍稀釋至濃度在 1.0×100～1.0×109拷貝/μL之間，取5μL作為模板。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR鑒定艱難梭菌特異性評(píng)價(jià) 本研究根據(jù)艱難梭菌tcdB基因作為檢測(cè)的靶基因，設(shè)計(jì)的引物和熒光探針序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析未發(fā)現(xiàn)與其同源序列，說(shuō)明引物探針的特異性較好。通過(guò)與本實(shí)驗(yàn)室保存的福氏志賀菌、空腸彎曲菌、產(chǎn)單核李斯特菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸埃希菌O157：H7、沙門菌和副溶血性弧菌同時(shí)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明僅有艱難梭菌出現(xiàn)陽(yáng)性響應(yīng)，其他無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明該方法特異性較好。

2.2 熒光PCR檢測(cè)艱難梭菌線性范圍分析 采用本研究建立的熒光PCR方法檢測(cè)上述系列稀釋的1.0×100～1.0×109拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果顯示，100～107拷貝/μL的8個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)響應(yīng)信號(hào)，而且CT值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)具有較好的線性關(guān)系，說(shuō)明本研究建立的方法能夠檢測(cè)1個(gè)拷貝的艱難梭菌，具有較高的靈敏度。

2.3 臨床糞便標(biāo)本檢測(cè) 采用生物梅里埃公司的VIDAS方法對(duì)278份糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，艱難梭菌毒素陽(yáng)性樣本18份；采用熒光PCR方法檢測(cè)顯示艱難梭菌陽(yáng)性標(biāo)本20份。兩種方法檢測(cè)艱難梭菌陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

艱難梭菌是引起醫(yī)源性腹瀉和抗生素相關(guān)性腹瀉的重要病原菌，一旦醫(yī)院感染暴發(fā)，芽胞的高抵抗力將使感染難以在短期內(nèi)得到有效控制。因此，臨床快速診斷艱難梭菌極其重要。艱難梭菌主要分泌細(xì)胞毒素而致病，不含毒素基因的無(wú)毒菌株為非致病菌[6]。因此單純?cè)诩S便培養(yǎng)中分離出艱難梭菌的診斷意義不大，必須進(jìn)行毒素的檢測(cè)。所以，國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是傳統(tǒng)的糞便標(biāo)本培養(yǎng)和細(xì)胞毒素測(cè)定[7]。但細(xì)菌培養(yǎng)法不僅操作繁瑣耗時(shí)而且容易漏檢，不適合快速診斷。目前一些實(shí)驗(yàn)室采用酶免疫方法檢測(cè)艱難梭菌，雖然該方法操作簡(jiǎn)便快速，但其靈敏度不高并且存在交叉反應(yīng)等問(wèn)題[8]。PCR應(yīng)用于臨床微生物領(lǐng)域最大的優(yōu)點(diǎn)在于其能夠快速檢測(cè)病原體而達(dá)到快速診斷的目的[9]。本研究建立的定量檢測(cè)艱難梭菌的熒光PCR方法能夠從糞便中直接檢測(cè)分泌毒素的艱難梭菌，并且具有較好的特異性，而且能夠檢測(cè)1個(gè)拷貝的艱難梭菌，具有較高的靈敏度；本方法與生物梅里埃公司的VIDAS方法比較具有較高的一致性，因此本方法能夠應(yīng)用于臨床檢測(cè)艱難梭菌感染，對(duì)快速診斷艱難梭菌感染，控制醫(yī)源性感染具有重要意義。

［1］ Kelly CP，LaMont JT.Clostridium difficile-more difficult than ever［J］.N Engl J Med，2008，359（18）：1932-1940.

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［3］ Nomura K，F(xiàn)ukumoto K，Shimizu D，et al.Pseudomembranous colitis presenting as acute colonic obstruction without diarrhea in a patient with gastric Burkitt lymphoma［J］.World J Gastroenterol，2005；11（17）：2681-2683.

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［5］李永強(qiáng)，聶玉強(qiáng)，楊銀梅.臨床分離艱難梭菌的耐藥性分析［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19（10）：922-925.

［6］ Heinlen L，Ballard JD.Clostridium difficile infection［J］.Am J Med Sci，2010，340（3）：247-252.

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