羅助榮，林 毅，張克己，鄭磊磊，徐高陽(yáng)

(本文編輯:張仲書(shū); 英文編輯:王建東)

自發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)在骨代謝調(diào)節(jié)中的重要功能以來(lái)，因其在血管性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮的重要作用引起了人們的廣泛關(guān)注［1］。但有關(guān)OPG基因多態(tài)性與急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的關(guān)系，國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在分析OPG基因啟動(dòng)子rs2073617T/C位點(diǎn)基因在福建漢族人群中的分布情況，以初步了解其多態(tài)性與ACS的發(fā)病及病變程度是否存在相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 ACS組360例均符合ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)［2-3］，其中男 216例，女144 例；對(duì)照組 120 例，男62例，女58例，均為福建地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系漢族人。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有急慢性感染、惡性腫瘤、風(fēng)濕性心臟病、瓣膜鈣化、嚴(yán)重肝腎功能異常、重度心功能衰竭、甲狀腺或腎上腺功能紊亂、鈣代謝異常及免疫系統(tǒng)疾病等均予排除。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動(dòng)脈造影 采用Judkins法按常規(guī)操作。根據(jù)1984年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)規(guī)定的冠脈血管圖像分段評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：冠脈造影顯示任何1、2、3枝主要冠狀動(dòng)脈一段狹窄＞50%為單枝、雙枝、三枝病變，左主干病變計(jì)為2枝病變。根據(jù)Gensini積分系統(tǒng)對(duì)各枝血管狹窄程度進(jìn)行定量分析：無(wú)異常發(fā)現(xiàn)為0分、狹窄＜25%為1分、26% ～50%為2分、51%～75%為4分、76% ～90%為8分、91% ～99%為16分、100%為32分，患者冠狀動(dòng)脈病變程度的最終積分為各分枝積分之和。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 清晨空腹采肘靜脈血5 ml，3000 r/min(離心半徑8 cm)，離心10 min取血清，采用Olympus Au2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.3 靜脈血基因組DNA提取 所有受試者禁食12 h后清晨空腹采血，EDTA抗凝，采用美國(guó)OMEGA公司全血DNA分離提純?cè)噭┖刑崛』蚪MDNA，-20℃保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 應(yīng)用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增OPG基因啟動(dòng)子rs2073617T/C多態(tài)性片段。PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。OPG rs2073617T/C上游引物序列：5’-GAAGTGAAGGGGTCAGGCAGC-3，下游引物序列：5’-GTCTGTCTCTCTCTTGCTGTCTTCC-3，擴(kuò)增反應(yīng)體系 20μl，其中含滅菌雙氧水 12.8μl，10 × PCR反應(yīng)緩沖液 2μl，dNTPs 0.4μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10 μM)0.4μl，DNA 模板 2μl，Taq酶2 U，覆蓋石蠟油。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán) 35 次；72℃ 5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切和DNA測(cè)序檢測(cè) OPG rs2073617T/C PCR產(chǎn)物分別用HincII限制性酶(TaKaRa公司)于37℃水浴消化16 h，并經(jīng)電泳證實(shí)。同時(shí)PCR產(chǎn)物利用ABI370型DNA測(cè)序儀(ABI公司，USA)進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件。計(jì)算各基因型及等位基因頻率，兩組間基因型分布做Hardy-Wrinberg平衡分析，以確定研究樣本的群體代表性。計(jì)量資料以表示。組間計(jì)量資料比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，各組之間基因型和等位基因頻率分布采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、體重指數(shù)、高血壓、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，ACS組吸煙、糖尿病、HDL-C顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 研究對(duì)象的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性基因型分布在兩組中的觀察值與理論值相吻合，表明研究對(duì)象符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3 OPG rs2073617T/C基因多態(tài)性 經(jīng)HincII限制性酶酶切后可見(jiàn)三種基因型：855 bp處出現(xiàn)單個(gè)條帶為T(mén)T純合子，雜合子TC產(chǎn)生855 bp、460 bp和395 bp三條帶；純合子CC產(chǎn)生395 bp，460 bp二條帶。DNA測(cè)序鑒定的結(jié)果亦證實(shí)上述rs2073617T/C位點(diǎn)3種基因型的存在。電泳圖和測(cè)序圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 OPG基因rs2073617T/C酶切電泳及測(cè)序結(jié)果

圖2 OPG基因rs2073617T/C測(cè)序結(jié)果

2.4 OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性分布與比較與對(duì)照組比較，ACS組OPG基因rs2073617T/C多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 基因型及等位基因頻率在兩組間的分布［例(%)］

2.5 OPG rs2073617T/C位點(diǎn)多態(tài)性與ACS病變程度的關(guān)系 ACS患者根據(jù)冠脈造影結(jié)果分為單枝、雙枝、三枝病變組。其中單枝病變組166例、雙枝病變組100例和三枝病變組94例，對(duì)照組120例。OPG rs2073617T/C各基因型在四組之間比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。ACS患者三種基因型與冠狀動(dòng)脈Gensini評(píng)分間的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表3 OPG rs2073617T/C位點(diǎn)多態(tài)性與ACS病變枝數(shù)的關(guān)系［例(%)］

表4 OPG rs2073617T/C基因多態(tài)性與冠脈病變枝數(shù)Gensini評(píng)分的關(guān)系

3 討論

OPG于1997年在美國(guó)和日本兩家實(shí)驗(yàn)室同時(shí)被發(fā)現(xiàn)［4-5］，它是一種分泌型糖蛋白，其前體含有401個(gè)氨基酸的殘基，N-末端的21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，其mRNA在多種組織廣泛表達(dá)，如心臟、肺、甲狀腺、腎臟和骨等。它與細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體(RANKL)，核因子kB受體活化因子(RANK)組成OPG/RANKI/RANK系統(tǒng)。OPG系統(tǒng)與骨代謝，心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病等都有著密切的關(guān)聯(lián)。

Palazzuoli等［6］發(fā)現(xiàn)OPG水平在穩(wěn)定性冠心病中明顯增高，但低于ST段抬高的心肌梗死患者。不穩(wěn)定心絞痛和非ST段抬高的心肌梗死OPG水平升高但無(wú)顯著差異。Omland等［7］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素相比，OPG可以更好的預(yù)測(cè)急性冠脈綜合征患者遠(yuǎn)期死亡率和心力衰竭的發(fā)生。以上研究表明，OPG不僅能夠參與骨代謝，而且參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，并與ACS的發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)。因此，探討OPG基因多態(tài)性與ACS間的相關(guān)性具有重要意義。

人類(lèi)OPG基因是單拷貝基因序列，全長(zhǎng)29 kb，位于染色體8q23-24上具有5個(gè)外顯子。國(guó)外一些學(xué)者［8］初步發(fā)現(xiàn) OPG 950以及1181位點(diǎn)，其多態(tài)性與血管中層鈣化密切相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)在福建地區(qū)漢族人群中，OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性存在TC、TT、CC三種基因型，其在ACS組和對(duì)照組中的頻率分別為 43.3%、33.3%和 23.3%，以及47.7%、26.7%和25.6%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)；Ohmori等［9］對(duì)日本男性冠心病患者血清OPG進(jìn)行研究，結(jié)果顯示OPG基因型950C/C與ACS顯著相關(guān)，并且與血清OPG水平的升高有關(guān)。本研究根據(jù)造影結(jié)果將ACS患者分為單枝、雙枝、多枝病變組，并分析其與OPG基因多態(tài)性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPG基因rs2073617T/C基因型及等位基因頻率與冠狀動(dòng)脈病變枝數(shù)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)；對(duì)ACS患者病變程度Gensini評(píng)分，分析其與三種基因型間的關(guān)系顯示差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Soufi等［10］研究發(fā)現(xiàn) OPG不同位點(diǎn)的基因型與冠心病相關(guān)性差異較大，應(yīng)用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-梯度凝膠電泳判別OPG基因發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)突變位點(diǎn)：149 T/C、163 A/G、209 G/A、245 T/G、950 T/C(以上位點(diǎn)都在啟動(dòng)子區(qū)域)、1181 G/C(位于第l外顯子)6890 A/C(位于第4內(nèi)含子)。單個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生雖無(wú)獨(dú)立相關(guān)性，但950 T/C和1181 G/C位點(diǎn)的聯(lián)合多態(tài)性分析顯示攜帶950 TC/1181 GC或950 CC/1181 CC基因型的患者具有冠心病發(fā)病的高危因素。

本研究發(fā)現(xiàn)OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性與福建地區(qū)漢族人群中ACS的發(fā)生及冠狀動(dòng)脈病變程度無(wú)相關(guān)性。但并不能說(shuō)明OPG基因多態(tài)性與ACS沒(méi)有關(guān)系，因?yàn)楸狙芯績(jī)H選取了OPG基因的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，即OPG 950位點(diǎn)，很明顯探討OPG基因多個(gè)位點(diǎn)及連鎖多態(tài)性與ACS的相關(guān)性將更具有意義。

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