劉繼平，蘭洲，傅強(qiáng)，羅建光，馬世平，孔令義

(1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009;2.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

細(xì)胞增殖反應(yīng)是常用的免疫反應(yīng)評價(jià)指標(biāo)，機(jī)體內(nèi)或體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞在受到有絲分裂原等刺激后，可致細(xì)胞活化、細(xì)胞因子合成、細(xì)胞因子受體表達(dá)、細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖等細(xì)胞行為的變化。由于檢測手段具有可靠性、良好的重復(fù)性及簡便性等特點(diǎn)，故通過測定細(xì)胞增殖反應(yīng)來判斷免疫細(xì)胞的功能一直得到廣泛的應(yīng)用。免疫調(diào)節(jié)是六味地黃湯重要作用之一，以往研究均是對全方在免疫調(diào)節(jié)方面的研究，有關(guān)其免疫調(diào)節(jié)有效組分研究的報(bào)道很少。苷類成分是六味地黃湯方中重要活性成分，本實(shí)驗(yàn)采用脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，初步評價(jià)六味地黃湯中5種代表性苷類成分的免疫活性。

1 材料

1.1 動物

ICR小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，清潔級，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號:SCXK(蘇)2008－0010。飼養(yǎng)環(huán)境:中國藥科大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，動物分籠飼養(yǎng)，保持12h晝夜節(jié)律，室溫(22±1)℃，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物和試劑

芍藥苷、馬錢苷、莫諾苷、桃葉珊瑚苷、薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，均用DMSO配成10－2mol/L，微孔濾膜過濾，再用培養(yǎng)基配成 10－5、10－6、10－7mol/L);RPMI－ 1640 培養(yǎng)基、小牛血清(JIBCO)，MTT、LPS、ConA(Sigma)，DMSO(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

1.3 主要儀器

NOVAPHTHTM酶標(biāo)儀 (美國Bio－Rad公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo);XD－202倒置顯微鏡(江南);超凈工作臺(Boxun);BS110S電子分析天平(Sartorius);離心機(jī)(湘儀);貝克曼高速離心機(jī)。

2 方法［1］

2.1 脾淋巴細(xì)胞的制備

ICR小鼠脫臼處死，置75%酒精滅菌，取出脾臟置培養(yǎng)皿里，加3ml PBS沖洗，剔除脂肪和結(jié)締組織，棄去PBS，另加入5mL PBS，剪碎脾臟，吸取PBS液，經(jīng)尼龍布(100目)濾網(wǎng)過濾至10mL離心管中，4℃，1 000rpm離心10min，使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，加入3mL紅細(xì)胞裂解液，3min后，離心，棄去上清液，加PBS洗滌2次后，加入RPMI－1640培養(yǎng)液(10%小牛血清)5mL，懸浮脾細(xì)胞，作細(xì)胞計(jì)數(shù)及測定細(xì)胞的存活率，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。將收獲的淋巴細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色，檢測細(xì)胞存活率≥95%，即可用于實(shí)驗(yàn)。以上操作過程，細(xì)胞均在0～4℃放置。

2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組有靜息期細(xì)胞對照組、各濃度藥物直接刺激組、絲裂原刀豆蛋白(ConA)刺激T細(xì)胞組、絲裂原脂多糖(LPS)刺激B細(xì)胞組。

實(shí)驗(yàn)時每孔均加入2×106個/mL淋巴細(xì)胞100μL。然后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度六味地黃湯苷類單體，對照組加入相同體積的RPMI－1640完全培養(yǎng)液。絲裂原刺激分別加入終濃度為5μg/mL的ConA或10μg/mL的LPS。每個樣本均設(shè)6個復(fù)孔。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)44h后加入MTT 20μL使其終濃度為0.5mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出，1 500rpm離心10min，棄上清 100μL，再加入 DMSO 100μL 輕微振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm波長測每孔OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 不同濃度芍藥苷對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

10－5M芍藥苷能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯的協(xié)同作用，10－7～10－6M芍藥苷對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 芍藥苷對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=6)

3.2 不同濃度薯蕷皂苷元對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

10－6～10－5M薯蕷皂苷元能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有協(xié)同作用，10－7M薯蕷皂苷元對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有協(xié)同作用，但與對照組比較均無顯著性差異。結(jié)果見表2。

表2 薯蕷皂苷元對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=6)

3.3 不同濃度馬錢苷對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

10－7～10－5M馬錢苷能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，10－7M馬錢苷對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有顯著協(xié)同作用，隨劑量增加，增殖作用反而降低。結(jié)果見表3。

表3 馬錢苷對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=6)

3.4 不同濃度莫諾苷對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

10－7～10－5M莫諾苷能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯的協(xié)同作用，對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果見表4。

表4 莫諾苷對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=6)

3.5 不同濃度桃葉珊瑚苷對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

10－7～10－5M桃葉珊瑚苷基本無促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用，10－5M桃葉珊瑚苷對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯的協(xié)同作用，10－7～10－5M桃葉珊瑚苷對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 桃葉珊瑚苷對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=6)

4 討論

淋巴細(xì)胞是機(jī)體的重要免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是檢測淋巴細(xì)胞增殖活性的一種有效的方法，常用于評價(jià)藥物對機(jī)體免疫功能的影響。ConA可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL－2受體，使T淋巴細(xì)胞活化。LPS是B細(xì)胞的多克隆激活劑，直接刺激B細(xì)胞發(fā)生有絲分裂。

六味地黃湯的免疫調(diào)節(jié)是其重要作用之一，脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖增強(qiáng)是其作用機(jī)理之一，以往研究均是對全方在免疫調(diào)節(jié)方面的研究，有關(guān)其免疫調(diào)節(jié)有效組分研究的報(bào)道很少，苷類成分是六味地黃方中重要活性部位。芍藥苷具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用［2－4］。尤其是對自身免疫性疾病的治療有著積極的作用。本實(shí)驗(yàn)中芍藥苷在較高濃度對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用，而在低濃度對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有明顯的協(xié)同作用。喬善義［5］在研究中發(fā)現(xiàn)，莫諾苷具有促進(jìn)脾細(xì)胞增殖作用，而近年來研究主要集中在神經(jīng)保護(hù)方面，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莫諾苷能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，且對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞和ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞均有明顯增殖作用。馬錢苷作為山茱萸中環(huán)烯醚萜類的主要成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗休克等作用。無論在體內(nèi)與體外，適當(dāng)濃度的馬錢子苷能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，高濃度時則有抑制作用，提示馬錢子苷對免疫反應(yīng)有雙相調(diào)節(jié)作用［6］。趙武述等［7］在研究中也發(fā)現(xiàn)，無論是體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，合適濃度的馬錢子苷對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、IL－2產(chǎn)生、LAK細(xì)胞生成均有促進(jìn)作用，高濃度時則有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，馬錢苷僅在10－7M濃度對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有協(xié)同作用，濃度增高反而抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。桃葉珊瑚苷和薯蕷皂苷元未見免疫方面報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桃葉珊瑚苷在較高濃度對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用，而在各濃度條件下對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞均有明顯增殖作用;薯蕷皂苷元在10－6～10－5M范圍內(nèi)對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖有明顯協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究六味地黃湯免疫調(diào)節(jié)作用，尋找高活性、高選擇性免疫調(diào)節(jié)劑打下了基礎(chǔ)。

［1］王敏，劉旭平，張建勤，等.黃芩苷對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，47(6):17 －19.

［2］Tang NY，Liu CH，Hsieh CT，et al.The anti－ inflammatory effect of paeoniflorin on cerebral infarction induced by ischemia－reperfusion injury in Sprague － Dawley rats［J］.The American journal of Chinese medicine，2010，38(1):51 －64.

［3］Tsuboi H，Hossain K，Akhand AA，et al.Paeoniflorin induces apoptosis of lymphocytes through aredox － linked mechanism［J］.J Cell Biochem，2004，93(1):162 －172.

［4］Wu H，Wei W，Song L，et al.Paeoniflorin induced immunetolerance of mesenteric lymph node lymphocytes via enhancing beta 2－adrenergic receptor desensitization in rats with adjuvant arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2007，7(5):662 －73.

［5］喬善義.六味地黃湯醇溶部位免疫活性成分研究多糖構(gòu)效關(guān)系的初步研究［D］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，1999:1－14.

［6］付桂香，李建民，周勇，等.山茱萸總苷抗炎免疫抑制作用及其機(jī)理的大鼠實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2007，27(4):314－320.

［7］趙武述，張玉琴，趙世萍，等.山茱萸成分的免疫活性研究［J］.中草藥，1990，21(3):113 －116.