魯美君，關(guān)利新，趙鑫，王懷剛，朱丹，朱孝娟，蘇云明

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000;3.齊齊哈爾市中醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000;4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150081)

腦血管病目前在全球疾病的死因中居第3位。根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，在全國(guó)主要城市中，腦血管病的死亡率居第2位，有的城市甚至是第1位，發(fā)病率高達(dá)125～180個(gè)/10萬(wàn)。我們國(guó)家的腦血管病從死亡率上看是全世界最高的國(guó)家，大概中國(guó)每年有150萬(wàn)人死于腦卒中。隨著人口老齡化速度的加快和人群預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，腦血管病發(fā)病率和患病率呈逐年增高的趨勢(shì)。

西洋參莖葉皂苷(PQS)是從西洋參莖葉中提取的總皂苷。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，其具有多方面的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線栓法建立大鼠局灶性腦缺血的模型［1－2］，通過(guò)ELISA法來(lái)檢測(cè)腦缺血大鼠血清中 S－100β的含量的方法來(lái)探討西洋參莖葉皂苷對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。西洋參莖葉皂苷由牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理教研室自制。尼莫地平片(091201，西安博愛制藥有限公司);酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)R＆D公司);酶標(biāo)儀(奧地利，anthos 2010);CFAP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(南京建成)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成高、低劑量組、西藥陽(yáng)性對(duì)照組，模型對(duì)照組及假手術(shù)組5組。高劑量給予西洋參莖葉皂苷100mg/kg，低劑量給予西洋參莖葉皂苷50mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予尼莫地平片21.6mg/kg，模型對(duì)照組及假手術(shù)組給予等容積生理鹽水。各組均灌胃給藥，連續(xù)7天，在末次給藥后0.5h，對(duì)大鼠實(shí)施右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型手術(shù)。

1.3 右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型制作

線栓的制備:單股尼龍線，直徑 0.23mm，長(zhǎng)30mm，經(jīng)酒精燈燒灼，使其一端形成光滑圓球狀，制成線栓，經(jīng)75%酒精消毒后備用。

水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。再將大鼠四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，常規(guī)消毒。在大鼠頸正中部切開，手術(shù)顯微鏡下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)以及 ECA和ICA的分支，并仔細(xì)分離迷走神經(jīng)(神經(jīng)節(jié)的刺激和損傷會(huì)引起大鼠呼吸驟阻)在ECA靠近ECA及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)分叉處結(jié)扎ECA，在已分離的CCA上結(jié)扎其近心端，遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾阻斷血流，并在CCA上預(yù)置一根縫合線。在CCA上位于動(dòng)脈夾和結(jié)扎處之間剪一“V”形切口。將線栓球面端插入CCA上的切口，打開ICA上預(yù)置的動(dòng)脈夾，將線栓經(jīng)CCA插入ICA內(nèi)，向前徐進(jìn)，向上插至MCA起始部，稍遇阻力即停止徐進(jìn)，此時(shí)自ECA、ICA分叉處計(jì)起，線栓推進(jìn)長(zhǎng)度約為18～20mm，造成MCA血供阻斷。將預(yù)置在CCA上的縫合線扎緊，防止出血和栓子滑出。復(fù)位組織，逐層縫合皮膚，術(shù)畢。術(shù)中大鼠出現(xiàn)呼吸困難、出血過(guò)多者棄之。

假手術(shù)組手術(shù)時(shí)，只分離頸總動(dòng)脈，但是不插入尼龍線，復(fù)位組織，逐層縫合皮膚。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

大鼠腦缺血的判定及研究納入標(biāo)準(zhǔn)采取五分法評(píng)分，于MCAO術(shù)后(大鼠意識(shí)恢復(fù)后30min)對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行評(píng)分。

0分:無(wú)神經(jīng)功能障礙;1分:左前爪不能充分外展;2分:行走時(shí)朝左轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí)朝左傾倒;4分:不能自主行走伴意識(shí)障礙。

MCAO術(shù)后計(jì)分在1～3分者納入研究。各組選取MCAO術(shù)后合格大鼠10只，納入研究。

大鼠術(shù)后24h取大鼠血液，離心后取血清。用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中S－100β的含量。酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，檢測(cè)儀器采用奧地利生產(chǎn)的anthos 2010酶標(biāo)儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其組間比較采用單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)觀察了24h以后，PQS對(duì)MCAO模型大鼠血清中S－100β含量的影響。結(jié)果顯示，在手術(shù)后模型組與假手術(shù)組比較，血清中的S－100β有顯著增加，其差異具有顯著性意義(P＜0.01)。同時(shí)高、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，血清中的S－100β蛋白均有不同程度的減少，高劑量組、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，具有顯著性意義(P＜0.05)。

Table.1PQS MCAO rats on the content of S－100β(s)

Table.1PQS MCAO rats on the content of S－100β(s)

注:Compared with model group，aP ＜ 0.05;Compared with sham group，dP ＜0.01。

Group n Dose(mg·kg－1)S －100β(ng/ml)Model 10 等體積水 12.07±1.61d Sham 10 等體積水 0.70±0.39 PQS(H)10 100 9.79 ±2.14a PQS(L)10 50 10.29 ±1.49a Nim 10 21.6 9.42 ±1.92a

3 討論

S－100β蛋白是神經(jīng)組織蛋白的一種，是More于1965年首次發(fā)現(xiàn)，因其在中性條件下能溶解于100%飽和硫酸銨中而得名。它是一種小分子酸性的鈣離子結(jié)合蛋白，分子量21 000道爾頓，S－100β蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布十分廣泛，高濃度存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或Shcwnan細(xì)胞中，被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白［3］。S－100β蛋白具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，能激活腦果糖1，6二磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝，促進(jìn)神經(jīng)的生長(zhǎng)和損傷后的修復(fù)［4］。并能通過(guò)微絲、微管等骨架成分直接或間接的相互作用以維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的完整性。急性腦缺血時(shí)，大量的腦膠質(zhì)細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致S－100β蛋白漏出到組織間液，同時(shí)急性腦缺血導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，血－腦屏障受損害，S－100β蛋白就越過(guò)血－腦屏障，自受損傷的腦組織釋放，這就提示了在血漿中測(cè)定S－100β蛋白能用來(lái)監(jiān)測(cè)腦缺血的病情程度及療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫法測(cè)定了MCAO模型大鼠血清中S－100β的含量，結(jié)果顯示，PQS給藥組大鼠血清中S－100β的含量低于模型組，說(shuō)明了PQS能減輕大鼠的腦缺血損傷。在臨床研究中我們認(rèn)為，急性腦缺血早期診斷和治療特別是超早期溶栓治療是提高療效，降低致殘率最有效的方法。但傳統(tǒng)的顱腦CT對(duì)腦缺血的診斷往往需要發(fā)病后24～48h才有陽(yáng)性結(jié)果，有時(shí)會(huì)延誤治療。而S－100β在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷時(shí)即出現(xiàn)在體液中，并與病變程度相關(guān)。這使我們對(duì)血清中S－100β的測(cè)定可以成為急性腦缺血早期診斷以及愈后程度的標(biāo)志。

［1］白云，顏培宇，梁穎.活血熄風(fēng)方對(duì)MCAO局灶性腦缺血模型大鼠腦皮質(zhì)ICAM－1蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(1):13－15.

［2］王懷剛，關(guān)利新，趙鑫，等.西洋參莖葉皂苷對(duì)局灶性腦缺血后大鼠血清中GFAP表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):17－19.

［3］唐紅霞，李文輝，施榮富，等.戊四氮致癎大鼠海馬S－100β蛋白變化及其相關(guān)性研究［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2004，17(3):221 －222.

［4］張曉琴.急性腦梗死患者血清肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子S－100β蛋白變化的意義［J］.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(5):405.