朱將偉

當(dāng)前，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中多采用集約化養(yǎng)殖方式，養(yǎng)殖水體水質(zhì)惡化是目前所面臨的迫切需要解決的問(wèn)題之一。水質(zhì)惡化不僅直接危害養(yǎng)殖對(duì)象，而且還可能誘發(fā)各種疾病而放大危害。隨著養(yǎng)殖面積增加，養(yǎng)殖布局密集，水源不足和水源污染已大大限制了換水的頻率和數(shù)量；用化學(xué)藥物（如抗生素）在防治病害的同時(shí)也產(chǎn)生了諸如細(xì)菌耐藥性、藥物污染、藥物殘留以及生態(tài)系統(tǒng)受損等很多新的問(wèn)題。Kozasa[1]于1986年首次將微生物制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,他利用東洋芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理鰻鱺，降低了由愛(ài)德華菌引起的死亡率，該研究為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中所遇到的問(wèn)題提供了一條新的路徑。近年來(lái)，復(fù)合微生物活菌制劑以其安全、無(wú)毒副作用、環(huán)保、無(wú)殘留等優(yōu)越性愈來(lái)愈受到重視，應(yīng)用微生物活菌制劑治理養(yǎng)殖污染、改善養(yǎng)殖環(huán)境、提高養(yǎng)殖質(zhì)量成為研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)研制了一種復(fù)合微生物制劑，并將其應(yīng)用于養(yǎng)殖水體的水質(zhì)改良，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。其中干酪乳桿菌和沼澤紅假單胞菌菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，其余菌株為自行分離并保存的菌株。

1.1.2 試劑

碘化鉀、碘化汞、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、硫代硫酸鈉、碘、可溶性淀粉、抗壞血酸：分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；氯化銨：優(yōu)級(jí)純，由Sigma-Aldrich生產(chǎn)；濃硫酸、濃鹽酸：分析純，由上海金山化工廠提供。

1.1.3 儀器

光照振蕩培養(yǎng)箱（華美QHZ-98B，中國(guó)太倉(cāng)制造），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津UV-2450，日本制造），冷凍干燥機(jī) (Christ ALPHA 2-4 LSC，德國(guó)制造)，鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9149A，上海生產(chǎn)），超凈工作臺(tái)（ESCO SCV-4A1，新加坡制造），離心機(jī)（Sigma 3K30，德國(guó)制造），pH計(jì)（梅特勒S20K，瑞士制造），溶氧儀（梅特勒SG6，瑞士制造）。

1.2 復(fù)合微生物制劑的制備

1.2.1 菌種的液體發(fā)酵

首先將各菌種在其適宜的培養(yǎng)條件下活化培養(yǎng)，再分別將其接種到培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)節(jié)OD600=1.5（若OD600＞1.5，用培養(yǎng)液稀釋至OD600=1.5；若OD600＜1.5可先離心后移去部分上清液，再調(diào)整至OD600=1.5），最后取相同體積的各菌株培養(yǎng)液混合，待干燥。

培養(yǎng)液配方：牛肉膏2 g、蛋白胨3 g、酵母膏1 g、馬鈴薯全粉（粉末）10 g、葡萄糖 15 g、NaCl 2 g、醋酸銨 2 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、水 1 000 ml，pH 值 7.0，121 ℃滅菌 30 min。

1.2.2 菌種的真空冷凍干燥

上述待干燥混合菌液在4℃下經(jīng)5 000 r/min離心10 min,移去上清液,加入凍干保護(hù)劑（配方為：脫脂乳粉10%、甘油8%的生理鹽水溶液），混勻制成菌懸液。-76℃預(yù)凍2 h，后將凍結(jié)樣品移入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥,使菌粉含水量≤3%。

1.3 復(fù)合微生物制劑菌體部分的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)試

取待干燥的混合菌液在4℃下經(jīng)5 000 r/min離心10 min，移去上清液；然后加入與移去的上清液等量的蒸餾水，混勻后5 000 r/min離心10 min，再移去上清液，重復(fù)兩次，以充分去除培養(yǎng)基成分。收集經(jīng)過(guò)離心、洗滌的菌體，先將菌體在80℃下干燥1 h，后以105℃恒溫保持3 h以上至恒重，然后迅速置于干燥器中冷卻備用。準(zhǔn)確稱取烘干的菌體，按照張曉琦(2007)[2]所述方法測(cè)定其粗蛋白、粗脂肪及粗纖維等。

1.4 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體的改良

模擬養(yǎng)殖池塘的尺寸是1 m×1 m×1 m；水源來(lái)自上海郊區(qū)垂釣場(chǎng)鯽魚(yú)養(yǎng)殖池的養(yǎng)殖用水；池水深70 cm，每池放養(yǎng)15條約250 g的鯽魚(yú)，水溫控制在20～25℃，每個(gè)池上方安裝1只100 W白熾燈作為自然光的補(bǔ)充（燈光在晚上7點(diǎn)至次日早晨7點(diǎn)關(guān)閉）。模擬池塘共設(shè)4組，每組3個(gè)重復(fù)，其中對(duì)照組不添加微生物制劑，第1、2、3組為試驗(yàn)組，添加復(fù)合微生物制劑的濃度分別為2、4和6mg/l。每隔3 d在各池的表層、中層、底層取樣，測(cè)定pH值、溶氧、氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硫化物含量，取平均值作為測(cè)定結(jié)果，連續(xù)測(cè)試12 d，比較水質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化情況。水質(zhì)監(jiān)測(cè)中各項(xiàng)指標(biāo)按水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[3]進(jìn)行。氨氮(NH4+-N)采用納氏試劑分光光度法；亞硝態(tài)氮(NO2--N)采用萘乙二胺分光光度法；硫化物采用亞甲基藍(lán)分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物制劑菌體部分的營(yíng)養(yǎng)成分

研究選用的4種微生物菌株均屬于農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告中允許使用的飼料級(jí)微生物，以保證所開(kāi)發(fā)的微生物制劑不會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生有害影響，并且能對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物起到一定的營(yíng)養(yǎng)或保健作用。微生物制劑菌體部分的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1，由表1中數(shù)據(jù)可以看出，其菌體粗蛋白含量高于大豆（大豆蛋白常是飼料中蛋白的主要來(lái)源），粗脂肪和粗纖維含量則與玉米相當(dāng)，由此推斷該微生物制劑菌體部分的營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，可能對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有很好的營(yíng)養(yǎng)作用。

表1 復(fù)合微生物制劑菌體部分的營(yíng)養(yǎng)成分(%)

2.2 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

2.2.1 復(fù)合微生物制劑對(duì)水體pH值的影響(見(jiàn)圖1)

投加不同濃度的微生物制劑對(duì)pH值并沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），另外，各試驗(yàn)組與沒(méi)有投加微生物制劑的對(duì)照組之間的差異也不顯著（P＞0.05）。在試驗(yàn)的12 d內(nèi)，養(yǎng)殖水體的pH值在7.59～7.78之間，該pH值適宜于大多數(shù)水產(chǎn)品的養(yǎng)殖（魚(yú)類能安全生活的pH值是7.0～8.5之間）。由此認(rèn)為，在以上試驗(yàn)條件下，是否投加微生物制劑或者投加不同劑量的微生物制劑對(duì)于養(yǎng)殖水體pH值的改善沒(méi)有明顯意義。但是，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，其養(yǎng)殖周期要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于12 d，投加微生物制劑對(duì)于養(yǎng)殖水體pH值的后期改善是否會(huì)產(chǎn)生作用還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 不同濃度的微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體pH值的影響

2.2.2 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中溶解氧的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 不同濃度的微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中溶解氧的影響

由圖2可知，投加微生物制劑后顯著增加水中的溶解氧，各試驗(yàn)組比對(duì)照組均有顯著增加（P＜0.05），據(jù)此可以認(rèn)為，微生物制劑使用后有增加養(yǎng)殖水體溶解氧的作用。當(dāng)微生物制劑投加量為4mg/l或6mg/l時(shí)，其增加溶解氧的量會(huì)顯著高于投加量為2mg/l時(shí)。但是投加量由4mg/l增至6mg/l時(shí)，水中溶解氧量沒(méi)有明顯變化，這可能意味著投加量為4mg/l時(shí)，該微生物制劑即能發(fā)揮其最大的增加溶解氧的功能。投加微生物制劑后溶解氧會(huì)持續(xù)增加到第9 d后開(kāi)始下降，可能是由菌群中各種微生物數(shù)量比例因競(jìng)爭(zhēng)或外界因素的影響而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化引起。

2.2.3 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 不同濃度的微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮的影響

由圖3可以看出，沒(méi)有投加微生物制劑的對(duì)照組隨著時(shí)間的推延，水中的氨氮含量持續(xù)上升，經(jīng)歷12 d后氨氮含量約增加50%。但是投加微生物制劑后，則可明顯導(dǎo)致水中的氨氮含量減少并維持在一定范圍。測(cè)試結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組比對(duì)照組均有非常顯著差異（P＜0.01），據(jù)此可以認(rèn)為，該微生物制劑使用后有降低養(yǎng)殖水體中氨氮含量的作用。當(dāng)微生物制劑投加量為4mg/l或6mg/l，其降低氨氮的作用會(huì)略高于投加量為2mg/l組，但差異不顯著。另外，從圖3中也能看出，使用微生物制劑后，水中氨氮含量并沒(méi)有立即下降，開(kāi)始3 d仍然呈升高趨勢(shì)，這可能是由于投加微生物制劑后其中的一些微生物菌株有一個(gè)適應(yīng)新環(huán)境的過(guò)程，還沒(méi)有得到充分的生長(zhǎng)繁殖，其發(fā)揮的降低氨氮的作用較小；經(jīng)歷一段時(shí)間后，微生物菌株的生長(zhǎng)和繁殖將更加充分，顯示出顯著降低水中氨氮的作用，后期微生物菌株將進(jìn)一步與水體環(huán)境相適應(yīng)，形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的平衡體系，最終將水中氨氮維持在一個(gè)較低的水平，這將有利于水中魚(yú)類的正常生長(zhǎng)。

2.2.4 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮的影響(見(jiàn)圖4)

由圖4可知，沒(méi)有投加微生物制劑的對(duì)照組隨著時(shí)間的推延，水中的亞硝態(tài)氮含量持續(xù)上升，持續(xù)升高12 d后亞硝態(tài)氮含量約增加150%左右；投加微生物制劑后，盡管水中的亞硝態(tài)氮含量仍有一個(gè)上升的過(guò)程，但其上升的幅度明顯降低。測(cè)試結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組比對(duì)照組均有極顯著差異（P＜0.01），因此推測(cè)該微生物制劑使用后對(duì)降低水中亞硝態(tài)氮含量有一定作用。當(dāng)微生物制劑投加量從2mg/l增加至6mg/l時(shí)，其降低亞硝態(tài)氮的作用會(huì)有一定變化，但統(tǒng)計(jì)表明差異不顯著（P＞0.05）。據(jù)報(bào)道，一些芽孢桿菌、光合細(xì)菌具有去除水中亞硝酸鹽的作用，存在于微生物制劑中的枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌或者水體中的某些天然菌株可能具有降低水中亞硝態(tài)氮的作用[4-5]。另外，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)推測(cè)，某些具有降低水中亞硝態(tài)氮作用的天然菌株由于在原始環(huán)境中并不占優(yōu)勢(shì)，使其發(fā)揮的作用十分有限，但是在投加人工微生物制劑后，原有的微生物生態(tài)體系發(fā)生變化，使非優(yōu)勢(shì)菌株獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)進(jìn)而發(fā)揮其特有功能。

圖4 不同濃度的微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮的影響

2.2.5 復(fù)合微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中硫化物的影響(見(jiàn)圖5)

圖5 不同濃度的微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中硫化物的影響

由圖5可知，未投加微生物制劑的對(duì)照組隨著時(shí)間的推延，水中硫化物含量持續(xù)上升，經(jīng)歷12 d后硫化物含量由0.170mg/l上升至0.256mg/l，約增加50%；但在投加微生物制劑后，則導(dǎo)致水中硫化物含量明顯減少（12 d減少約30%）。測(cè)試結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組與對(duì)照組均有極顯著差異（P＜0.01），故該微生物制劑有減少水中硫化物的功能。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枯草芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌等一些細(xì)菌具有分解H2S的功能[6-7]。當(dāng)微生物制劑投加量從2mg/l增加至6mg/l時(shí)，其降低水中硫化物的作用無(wú)顯著變化，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明差異不顯著（P＞0.05）。使用微生物制劑后，水中硫化物含量下降到一個(gè)較低的水平，這無(wú)疑有利于水產(chǎn)品養(yǎng)殖。

3 小結(jié)

本研究中制備的復(fù)合微生物制劑獲得了初步成功，主要表現(xiàn)在以下方面：①微生物制劑含有相當(dāng)豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，能在水產(chǎn)養(yǎng)殖中起到營(yíng)養(yǎng)水產(chǎn)動(dòng)物的作用；②該微生物制劑能起到改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)的作用，能增加水中的溶解氧，顯著降低氨氮、亞硝態(tài)氮、硫化物等不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的污染成分；③依據(jù)已經(jīng)取得的水質(zhì)改善的試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料推斷[8-9]，微生物制劑中所選用的菌株能對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物起到一定的保健作用，并有利于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量。盡管在該研究中獲得了初步成果，但仍有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步探討，主要是：①各微生物的配比需進(jìn)一步優(yōu)化；②微生物制劑適用的環(huán)境條件需要探討；③可否引入新的菌種來(lái)滿足特異性需要；④微生物制劑性能的穩(wěn)定性；⑤制劑中各微生物菌種之間的相互關(guān)系、與天然環(huán)境中的微生物之間的相互關(guān)系，以及產(chǎn)生相關(guān)功效的機(jī)理等。

[1]Kozasa M.Toyocerin(Bacillus toyoi)as growth promoter for animal feeding[J].Microbiologie Aliments Nutrition,1986,4(2):121-135.

[2]張曉琦.利用絲狀真菌生產(chǎn)菌體飼料的初步研究 [D].哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2007.

[3]國(guó)家環(huán)保局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M]第三版.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1994.

[4]孟睿，何連生，席北斗，等.芽孢桿菌與硝化細(xì)菌凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的試驗(yàn)研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009，32（11）：28-31.

[5]湯保貴，徐中文，張金燕，等.枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及對(duì)水質(zhì)的凈化作用[J].淡水漁業(yè)，2007，37（3）：45-48.

[6]張土保,許英梅,安立龍,等.養(yǎng)殖場(chǎng)中的惡臭及其營(yíng)養(yǎng)控制措施[J].飼料工業(yè)，2009，30（7）：48-52.

[7]雷愛(ài)瑩,彭敏,曾地剛,等.高效凈水沼澤紅假單胞菌的分離和鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，36(1)：57-58.

[8]丁麗，周維仁，章世元，等.益生菌在水產(chǎn)上的應(yīng)用及其對(duì)魚(yú)類腸道菌群的影響[J].飼料工業(yè)，2009，30(20)：27-30.

[9]崔華平，林煒鐵.固定化生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2008，27（4）：213-216.