魏 遠(yuǎn)

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091)

鄭施雯 朱建林 江澤平 陳 江

(寧波市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計院) (寧波大學(xué)) (中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所) (寧波大學(xué))

當(dāng)今，隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，“三廢”排放的日益增加，環(huán)境問題日趨嚴(yán)重，特別是重金屬污染已引起國內(nèi)外專家的極大關(guān)注。我國是世界皮革的加工中心和制革大國，制革行業(yè)每年約產(chǎn)生140萬t皮革廢棄物，其大部分被隨意丟棄，其中所含的重金屬Cr對土壤環(huán)境造成了嚴(yán)重污染［1］。重金屬Cr具有易積累、難排除的特性，不僅危害土壤質(zhì)量、地下水安全、作物產(chǎn)量品質(zhì)，而且會隨著食物鏈潛在威脅人畜健康。微生物本身僅占土壤有機(jī)質(zhì)的很小部分，但土壤微生物在C、N、S和其他元素循環(huán)中起著關(guān)鍵作用［2］。土壤微生物功能群的研究意義不僅關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而且關(guān)系到環(huán)境污染治理和恢復(fù)生態(tài)學(xué)領(lǐng)域［3-4］。土壤中一切生物化學(xué)過程都離不開土壤中各類酶的參與，同時土壤酶活性是衡量土壤生物學(xué)活性和土壤生產(chǎn)力的重要指標(biāo)［5］，其活性的大小能反映土壤的潛在肥力水平，可較敏感地反映土壤中生化反應(yīng)的方向和深度，是探討重金屬污染生態(tài)效應(yīng)的有效指標(biāo)之一［6］，在重金屬生態(tài)毒理、污染監(jiān)測評價及修復(fù)等方面研究中，土壤酶是國內(nèi)外關(guān)注的主要課題之一。近年來，國內(nèi)外相關(guān)研究先后提出了脲酶、轉(zhuǎn)化酶、過氧化氫酶等重金屬污染指標(biāo)［7-8］。目前，關(guān)于重金屬Cr對土壤微生物及酶的影響報道不多，但關(guān)于工業(yè)產(chǎn)生的一些含Cr廢水對土壤微生物及酶的影響卻鮮見報道［9-13］，而制革等行業(yè)都會產(chǎn)生較高質(zhì)量濃度的含Cr廢水。本研究旨在研究重金屬Cr對土壤微生物及脲酶和過氧化氫酶活性的影響，從而間接明確重金屬Cr對土壤肥力狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2008年在寧波大學(xué)內(nèi)建造面積約為140 m2的實(shí)驗(yàn)溫室大棚，進(jìn)行土培Cr脅迫試驗(yàn)。根據(jù)課題實(shí)施計劃從浙江寧波奉化苗圃購入柏木(Cupressus funebris Endl.)、側(cè)柏(Platycladus orientalis(Linn.)Franco)、刺柏(Juniperusformosana Hayata)、女貞(Ligustrum lucidum Ait.)、桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)、夾竹桃(Nerium indicum Mill.)、四季竹(Oligostachyum lubricum(Wen)Keng f.)、銀 杏 (Ginkgo biloba Linn.)、杜鵑(Rhododendron simsii Planch.)、山茶(Camellia japonica Linn.)、臭椿(Ailanthus altissima(Mill.)Swingle)、棕櫚(Trachycarpus fortunei(Hook.)H.Wendl.)、廣玉蘭(Magnolia grandiflora Linn.)、樟 樹 (Cinnamomum camphora(L.)Presl)、大花美人蕉(Canna generalis Bailey)和爬山虎(Parthenocissus tricuspidata(Sieb.et Zucc.)Planch.)共 16 種植物作為試驗(yàn)植物種質(zhì)，試供土壤為奉化苗圃土，土壤pH值6.5，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.27%。

1.2 重金屬處理

將買回的植物種入上直徑為36 cm，高為30 cm的陶瓷盆內(nèi)，向土壤中加入不同質(zhì)量濃度的Cr作為處理，Cr以CrCl3·6H2O形態(tài)溶于水箱的水中，通過ZQDF型蒸汽電磁閥和HT-12K微電腦多功能控制器將處理過的水定時定量通過滴灌系統(tǒng)注入每盆試供植物的土壤中，對于部分滴水效果不太理想的進(jìn)行人工澆灌已知質(zhì)量濃度的Cr溶液，來保證不同處理水平達(dá)到試驗(yàn)預(yù)定的Cr質(zhì)量濃度要求。共設(shè)置對照組(CK，不加Cr)和7、14、21 mg·L-1(以Cr3+計)3個處理水平(分別定義為處理1、處理2和處理3)，每個水平每種植物設(shè)置5個平行。2008年6月，將買入的試供植物種入盆內(nèi)，穩(wěn)定生長5個月，從2008年12開始運(yùn)行，除去寒假實(shí)驗(yàn)室停電裝置暫停運(yùn)行一個月外，至2009年8月共運(yùn)行9個月。

1.3 采樣方法

土樣于2009年9月采集，根據(jù)常規(guī)取樣方法，在各處理水平下分別對栽種每種植物的5個盆進(jìn)行采樣，采集5～20 cm的土壤層，混合均勻不同樣點(diǎn)土樣及植物幼根，裝入無菌袋內(nèi)，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，供測定研究使用。

1.4 測定方法

土壤主要化學(xué)性質(zhì)測定：土壤pH值(H2O)的測定采用電位法，使用pHs-25型pH計(雷磁)測定。土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用重鉻酸鉀容量法測定。

土壤重金屬測定：土壤中重金屬含量測定采用微波消解—原子吸收分光光度法。精確稱取土壤樣品0.400 0 g于ETHOS1/A微波消解儀(MDS)消解罐中，加8 mL HNO3和2 mL H2O2，運(yùn)用消解儀設(shè)定的消解程序進(jìn)行消解，結(jié)束后開罐趕酸，用超純水將消解液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容，過濾去除雜質(zhì)，待測。待測溶液視測定條件酌情適當(dāng)稀釋。分析過程分別加入國家標(biāo)準(zhǔn)土壤樣品(GSS-1)和國家標(biāo)準(zhǔn)植物樣品(GSV-3)進(jìn)行分析質(zhì)量控制。待測溶液通過TAS-990原子吸收分光光度計(北京普析)進(jìn)行測定。

土壤樣品微生物測定：微生物數(shù)量的測定采用菌落平板計數(shù)法。不同類群的微生物使用不同的培養(yǎng)基，細(xì)菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌為高氏1號培養(yǎng)基，真菌為薩布(Sabouraud’s)培養(yǎng)基［14］。28～30 ℃培養(yǎng)，定時觀察、計數(shù)(Shineso全自動菌落計數(shù)儀AS1)。

土壤酶活性測定：土壤脲酶活性的測定采用苯酚—次氯酸鈉比色法，其活性以24 h后1.0 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示;土壤過氧化氫酶活性的測定采用容量法［15］。

數(shù)據(jù)相關(guān)分析、回歸分析及繪圖工作由 Origin8.0、SPSS13.0和MATLAB7.0等分析軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr脅迫對土壤的基本理化性質(zhì)的影響

從奉化苗圃運(yùn)回的供試土壤pH值6.5，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.27%。經(jīng)過9個月的土培試驗(yàn)后，土壤的基本理化性質(zhì)見表1。從表1可以看出：土壤pH均呈一定的酸性，且在一定程度上有所降低，不同植物生長的土壤pH也有所不同(具體數(shù)據(jù)未列出);土壤中有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，該土屬于低肥土，有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有所降低，不同植物生長的土壤有機(jī)質(zhì)也有所不同(具體數(shù)據(jù)未列出)。這可能是由于滴灌系統(tǒng)用水pH呈弱酸性，未對土壤進(jìn)行施肥，盆栽試驗(yàn)植物生長以及土壤中Cr3+的加入等的綜合作用的結(jié)果。

表1 土培Cr脅迫試驗(yàn)后土壤基本理化性質(zhì)

從奉化苗圃運(yùn)回的供試土壤的Cu、Pb、Zn、Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 45.31、63.19、95.24、180.46 mg·kg-1，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于全國的土壤背景值，但均在土壤環(huán)境質(zhì)量二級標(biāo)準(zhǔn)(GB15618—1995)以內(nèi)，可認(rèn)為供試土壤是無重金屬污染土壤。經(jīng)過9個月的土培試驗(yàn)后，土壤重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表2。3個處理水平及對照組土壤的4種重金屬(Cu、Pb、Zn、Cr)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于全國的土壤背景值。其中經(jīng)過處理后的土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高，是全國背景值的7～13倍。從土壤環(huán)境質(zhì)量二級標(biāo)準(zhǔn)(GB15618—1995)來看，經(jīng)過處理后的土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)超過污染警戒值，是二級標(biāo)準(zhǔn)的1.7～3.6倍，可能是由于試驗(yàn)時間還不夠長，對試驗(yàn)結(jié)果基本不產(chǎn)生影響。土培試驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)處理后的土壤Cu、Pb、Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及對照組的Cu、Pb、Zn、Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在二級標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)，較供試土壤的原始質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低，但降低的程度很小。

表2 不同土培試驗(yàn)下土壤重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·kg-1

2.2 Cr脅迫對土壤微生物數(shù)量的影響

土壤微生物是決定土壤生物化學(xué)特性的重要組成部分，其數(shù)量的多少直接影響土壤的物理、生物和化學(xué)性質(zhì)，決定著土壤養(yǎng)分的組成與轉(zhuǎn)化，同時也是評價土壤肥力的重要指標(biāo)之一。目前，采用微生物學(xué)指標(biāo)來表征土壤重金屬污染越來越受到人們的普遍關(guān)注。龍健等［16］研究發(fā)現(xiàn)，銅礦區(qū)重金屬污染對土壤環(huán)境質(zhì)量微生物學(xué)指標(biāo)有較大的影響。土壤微生物對重金屬的脅迫要比同一環(huán)境中的動物和植物敏感得多，被認(rèn)為是最有潛力的評價土壤環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)［17］。從表3中可以看出：對于同一個處理下的土壤，3大類微生物的數(shù)量呈現(xiàn)出相似的變化特點(diǎn)，即：細(xì)菌＞放線菌＞真菌。細(xì)菌的營養(yǎng)類型多樣，呼吸機(jī)制復(fù)雜，代謝旺盛，繁殖快，所以各處理水平中的細(xì)菌的數(shù)量最多。土壤中的放線菌主要以鏈霉菌為主，大部分放線菌屬好氧腐生菌，對纖維素、幾丁質(zhì)、固醇類等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難降解天然有機(jī)物有較強(qiáng)的利用能力。一般來說，土壤中的真菌數(shù)量總是小于細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，但由于其孢子、菌核和菌索的忍耐力較強(qiáng)，因此，可廣泛分布于各種類型的土壤中。對于對照組(CK)及3個不同Cr處理的土壤，對照組中的細(xì)菌、放線菌和真菌，其數(shù)量均為最大，隨著處理質(zhì)量濃度的不斷增大，土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌均有不同程度的降低。

2.3 Cr脅迫對土壤脲酶活性的影響

土壤脲酶在土壤系統(tǒng)氮素循環(huán)過程中起著重要作用，人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況［18］。在研究重金屬對土壤污染時，通常將土壤對土壤脲酶的影響作為一個主要內(nèi)容。國內(nèi)外學(xué)者對重金屬污染條件下的酶活性進(jìn)行了大量的研究，對于土壤脲酶，重金屬對其活性的影響與重金屬種類和濃度以及土壤理化性質(zhì)有關(guān)［19-20］。楊志新等［21］通過回歸正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重金屬對土壤酶活性的抑制效應(yīng)順次為Cd＞Zn＞Pb;同時，Cd、Zn、Pb復(fù)合污染對土壤脲酶表現(xiàn)出協(xié)同抑制負(fù)效應(yīng)的特征，在過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶中，脲酶受重金屬的抑制作用最為敏感。有關(guān)土壤中的Cr對脲酶的影響方面的研究較少，蔡少華等［22］采用室內(nèi)模擬方法較為系統(tǒng)地研究了六價水溶態(tài)鉻和總鉻對土壤脲酶活性的影響，結(jié)果表明六價鉻抑制土壤脲酶活性，其活性與六價水溶態(tài)鉻達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，揭示脲酶活性可作為土壤Cr污染程度的指標(biāo)之一;對于低肥土，土壤中六價總鉻質(zhì)量濃度增加，脲酶活性持續(xù)遞減。對于三價鉻對土壤脲酶活性的研究少之甚少，因此筆者研究了不同Cr3+處理水平下土壤總Cr質(zhì)量濃度對土壤脲酶活性的影響。結(jié)果表明，不同樣點(diǎn)土壤脲酶活性存在一定程度的差異性，其變化范圍：處理1為0.301～0.721 mg·(g·d)-1;處理2 為0.214～0.404 mg·(g·d)-1;處理3 為0.101～0.389 mg·(g·d)-1;對照組(CK)為0.503～0.861 mg·(g·d)-1。從相關(guān)系數(shù)來看，脲酶活性的變化幅度較大。總體來說，Cr的加入抑制了土壤脲酶的活性。從圖1中可知，脲酶活性與土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=-0.862，p＜0.01)，揭示Cr可明顯抑制土壤脲酶活性。

表3 不同水平Cr脅迫下土壤中微生物數(shù)量 ×105

圖1 脲酶活性與土壤的Cr金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)回歸分析

2.4 Cr脅迫對土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶廣泛存在于土壤中和生物體內(nèi)，其活性在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程的強(qiáng)度，也可表征土壤總的生物學(xué)活性和肥力狀況。由于土壤中一些酶的活性能較穩(wěn)定、敏感地反映重金屬對土壤的污染程度，人們開始注重探討用土壤酶活性作為判定土壤污染程度的生化指標(biāo)。目前已經(jīng)有人發(fā)現(xiàn)用脲酶、過氧化氫酶活性可作為判斷土壤中全量Cd、Pb 污染程度的主要生化指標(biāo)［10，23-24］。Naseby 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，Cd、Zn、Pb共存時，其對過氧化氫酶表現(xiàn)出一定的拮抗作用或屏蔽作用，尤其Pb質(zhì)量濃度較高時，屏蔽作用較為明顯。羅虹等［26］采用回歸正交設(shè)計方案，研究了 Cd、Cu、Ni復(fù)合污染對6種土壤酶(脲酶、轉(zhuǎn)化酶、蛋白酶、磷酸酶、過氧化氫酶、脫氫酶)活性的影響，結(jié)果表明：6種土壤酶活性與Cd、Cu、Ni復(fù)合污染之間均呈顯著或極顯著的相關(guān)性，但對酶活性的影響存在明顯的差異，Cd、Cu對其活性的影響多表現(xiàn)為抑制性，而Ni則多表現(xiàn)為激活作用。但對于土壤中重金屬Cr對土壤過氧化氫酶活性影響方面的研究很少。本研究結(jié)果表明，不同樣點(diǎn)土壤過氧化氫酶活性存在一定程度的差異性，其變化范圍：處理1 為3.468～13.176 mL·(g·h)-1;處理2 為3.402～12.405 mL·(g·h)-1;處理3 為1.527～11.90 mL·(g·h)-1;對照組(CK)為 5.235～15.549 mL·(g·h)-1。從相關(guān)系數(shù)來看，過氧化氫酶活性的變化幅度一般?？傮w來說，Cr的加入抑制了土壤過氧化氫酶的活性。從圖2中可知，過氧化氫酶活性與土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù) r=-0.650，p＜0.01)，揭示 Cr可抑制土壤過氧化氫酶活性。

圖2 過氧化氫酶活性與土壤Cr金屬含量回歸分析

3 結(jié)束語

在土培Cr脅迫試驗(yàn)中，處理水平下土壤中微生物數(shù)量為細(xì)菌＞放線菌＞真菌，土壤中重金屬Cr質(zhì)量濃度的增加在一定程度上抑制微生物的生長，最終導(dǎo)致土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量的減少。土壤脲酶活性與土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.862)，揭示Cr可明顯抑制土壤脲酶活性，機(jī)理可能是由于Cr與土壤脲酶活性中心或與酶分子的巰基、氨基和羧基結(jié)合，影響了土壤酶與底物的結(jié)合［25］，最終導(dǎo)致酶活性降低，表明土壤脲酶活性在一定程度上可監(jiān)測土壤受三價鉻污染程度。過氧化氫酶活性與土壤Cr質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.650)，揭示Cr可抑制土壤過氧化氫酶活性，但其抑制效應(yīng)低于Cr對土壤脲酶活性的抑制，表明其活性在一定程度上也可表征土壤受三價Cr污染程度。

［1］周加祥，劉錚.鉻污染土壤修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2000，1(4)：52-56.

［2］李阜隸，喻子牛，何紹江.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

［3］于壽娜，廖敏，黃昌勇.鎘、汞復(fù)合污染對土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19(8)：1841-1847.

［4］趙萌，李敏，王淼焱，等.西瓜連作對土壤微生物主要類群和土壤酶活性的影響［J］.微生物學(xué)通報，2008，35(8)：1251-1254.

［5］周禮愷.土壤酶學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

［6］王新，周啟星.土壤重金屬污染生態(tài)過程、效應(yīng)及修復(fù)［J］.生態(tài)科學(xué)，2004，23(3)：278-281.

［7］尹君，高如泰，劉文菊，等.土壤酶活性與土壤Cd污染評價指標(biāo)［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，1999，18(3)：130-132.

［8］李博文，劉樹慶.潮褐土鎘、鋅、鉛復(fù)合污染與土壤酶活性的關(guān)系［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，25(1)：38-41.

［9］蔡少華，和文祥，呼蕾，等.六價鉻對土壤脫氫酶活性的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17(5)：208-214.

［10］周禮愷，張志明，曹承綿，等.土壤的重金屬污染與土壤酶活性［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，1985，5(2)：176-184.

［11］Grigorydn K V，Galstyan A S.Effect of irrigation water polluted with industrial waste on the enzymatic activity of soils［J］.Soviet Soil Science，1979，11(2)：220-228.

［12］和文祥，陳會明，馮貴穎，等.汞鉻砷元素污染土壤的酶監(jiān)測研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2000，20(3)：338-343.

［13］Renella G，Origoza A L R，Landi L，et al.Additive effects of copper an zinc on cadmium toxicity on phosphatase activities an ATP content of soil as eatimated by the ecological dose(ED50)［J］.Soil Biology ＆ Biochemistry，2003(35)：1203-1210.

［14］黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2001.

［15］關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1986.

［16］龍健，黃昌勇，縢應(yīng)，等.礦區(qū)重金屬污染對土壤環(huán)境質(zhì)量微生物學(xué)指標(biāo)的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2003，22(1)：60-63.

［17］孫波，趙其國，張?zhí)伊郑?土壤質(zhì)量與持續(xù)環(huán)境Ⅲ：土壤質(zhì)量評價的生物學(xué)指標(biāo)［J］.土壤，1997，29(5)：225-234.

［18］和文祥，朱銘莪，張一平.土壤酶與重金屬關(guān)系的研究現(xiàn)狀［J］.土壤與環(huán)境，2000，9(2)：139-142.

［19］滕應(yīng)，駱永明，李振高.土壤重金屬復(fù)合污染對脲酶、磷酸酶及脫氫酶的影響［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2008，28(2)：147-152.

［20］孫兆海，鄭春榮，周東美，等.土壤鉛污染對青菜和蕹菜生長及脲酶活性的影響［J］.農(nóng)村生態(tài)環(huán)境，2005，21(1)：38-43.

［21］楊志新，劉樹慶.重金屬Cd、Zn、Pb復(fù)合污染對土壤酶活性的影響［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2001，21(1)：60-63.

［22］蔡少華，和文祥，梁艷茹，等.六價鉻污染土壤后形態(tài)變化及其對土壤脲酶活性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28(2)：251-255.

［23］史長青.重金屬污染對水稻土酶活性的影響［J］.土壤通報，1995，26(1)：34-35.

［24］劉樹慶.保定市污灌區(qū)土壤的Pb、Cd污染與土壤酶活性關(guān)系研究［J］.土壤學(xué)報，1996，33(2)：175-182.

［25］Naseby D C，Lynch JM.Rhizosphere soil enzymesasindicators of perturbations caused by enzyme substrate addition and inocubation of a genetically modifled strain of Pseudomonas fluoresces as wheat seeds［J］.Soil Biol Biochem，1997，29：1353-1362.

［26］羅虹，劉鵬，宋小敏.重金屬鎘、銅、鎳復(fù)合污染對土壤酶活性的影響［J］.水土保持學(xué)報，2006，20(2)：94-96，121.