孫宇涵 楊妮娜 袁存權(quán) 胡瑞陽 李 云 王 謙

(林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (北京林業(yè)大學(xué))

微管是由α、β微管蛋白異源二聚體及少量微管結(jié)合蛋白聚合而成的亞穩(wěn)定動態(tài)結(jié)構(gòu)，具有廣泛的生物學(xué)功能和獨特的細胞動力學(xué)特性［1］，它是細胞骨架的主要組成部分，細胞中的細胞器如紡錘體和中心粒等都是由微管參與組成的，它在維持細胞形態(tài)、支持細胞分裂、協(xié)助細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸和能量轉(zhuǎn)換等方面有著重要作用。

間接免疫熒光法是以一抗抗體作為媒介，使抗原間接與有熒光素標記的二抗抗體結(jié)合，通過檢測二抗抗體上的熒光信號間接進行抗原檢測的技術(shù)。由于該方法具有特異性強和靈敏度高的特點，目前已廣泛應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)定位和細胞形態(tài)研究中［2-3］。利用間接免疫熒光法定位微管，在動物上研究較多，在植物上的研究大都集中在水稻、小麥和白菜等作物上［4-6］，在觀賞用百合科植物上也曾有報道［7］，但在木本植物尤其是裸子植物領(lǐng)域的研究中報道較少。本研究以銀杏(Ginkgo biloba L.)雄株生殖細胞為材料，對傳統(tǒng)免疫熒光染色法的前期制片方式以及酶解等步驟進行了優(yōu)化，將其與Bednara等［8］提出的PEG包埋切片法相結(jié)合，建立了適用于銀杏細胞微管的最佳免疫熒光觀察體系，并對銀杏雄株生殖細胞減數(shù)分裂時期的微管及染色體的變化情況進行了研究，為今后裸子植物的微管骨架研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

主要試劑與儀器：多聚甲醛，MBS(Sigma公司生產(chǎn)，編號M2786)，PEG4000，PEG1500，anti- α -tubulin(Sigma公司生產(chǎn)，編號 T-9026)，anti-mouse IgG FITC conjugated(Sigma公司生產(chǎn)，編號F-0257)，PI(碘化丙啶)，ATF(抗熒光衰減封片劑)，萊卡 TCS-SP2激光共聚焦掃描顯微鏡和萊卡RM2235型石蠟切片機等。

觀察材料的選備：銀杏材料取自北京林業(yè)大學(xué)鷲峰林場的30年生銀杏雄株。銀杏雄株經(jīng)切枝后將枝條立即放入溫室中20～30℃水培催芽，每2天定時換水，并對其生殖細胞發(fā)育狀態(tài)進行跟蹤觀察，當其發(fā)育即將進入減數(shù)分裂時，取銀杏小孢子囊，按6 h間隔進行取樣，直至減數(shù)分裂結(jié)束。

材料的固定及包埋：①材料固定。用微管固定劑(含4%多聚甲醛，10%DMSO，0.01%MBS，1%TritonX-100，50 mmol/L Pipes，5 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgSO4，4% 蔗糖，pH值6.9)對樣品進行定期固定，固定時間為60 min。②沖洗。將材料從固定液中取出，用PEMS沖洗液(含10%DMSO，0.01%MBS，1%TritonX-100，50 mmol/L Pipes，5 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgSO4，4%蔗糖，pH 值 6.9)仔細清洗 3次，每次 5 min;再用 PEM 緩沖液(50 mmol/L Pipes，5 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgSO4，pH 值6.9)仔細清洗3次，每次5 min;最后用蒸餾水仔細清洗3次，每次5 min。③脫水。將清洗后的材料分別用 10% 、20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90% 的乙醇溶液依次脫水處理，每次脫水時間均為30 min，最后用無水乙醇脫水3次。第1次在室溫下進行，處理20 min;第2次在恒溫箱內(nèi)(55℃)進行，處理20 min;第3次直接使用預(yù)先加熱到55℃的無水乙醇在恒溫箱內(nèi)55℃進行，處理20 min。④滲透。將脫水處理后的材料轉(zhuǎn)入1號滲透劑(V(PEG混合液)∶V(無水乙醇)=1∶2)中并放入恒溫箱內(nèi)55℃保溫30 min，然后轉(zhuǎn)入2號滲透劑(V(PEG混合液)∶V(無水乙醇)=1∶1)中繼續(xù)55℃保溫30 min，再轉(zhuǎn)入3號滲透劑(V(PEG混合液)∶V(無水乙醇)=2∶1)中持續(xù)55℃保溫30 min，最后轉(zhuǎn)入PEG混合液(V(PEG4000)∶V(PEG1500)=1∶3)中持續(xù)55℃保溫60 min;更換一次純PEG混合液，繼續(xù)55℃保溫60 min。⑤切片。先將PEG混合液加入包埋管中，然后加入已經(jīng)滲透完全的包埋材料，55℃靜置1 h后在室溫下聚合，當聚合完成包埋管內(nèi)的PEG混合液充分凝固后，取出PEG凝固塊，進行切片。

粘片：將所得PEG凝固塊切片采用2種不同的粘片方式固定于玻璃載片上，一種是采用蛋清黏合劑(100 mL蛋清黏合劑中含有50 mL蛋清，50 mL甘油和1 g麝香草酚)將所得PEG凝固塊切片粘于玻璃載玻片上;另一種是采用朱洪亮等［9］最新發(fā)明的真空粘片法將所得PEG凝固塊切片先置于預(yù)先滴有少量蒸餾水的載玻片上，然后將載片移入真空泵中干燥處理30 min。采用2種方法同步制片，并進行后期的相關(guān)處理。

細胞壁的酶解處理：為驗證無酶解處理對本文所述研究方法的影響情況，研究中對所制部分樣片采用酶解液(100 mL酶解液中含1.0 g果膠酶和2.0 g纖維素酶)在30℃下酶解30 min，作為無酶解處理觀察的對照。

免疫熒光標記：①抗體標記前的預(yù)處理。將制好的樣片用蒸餾水緩速沖洗5次，每次5 min，然后用PBS緩沖液(0.137 mol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.47 mmol/L KH2PO4，8.1 mmol/L，Na2HPO4，pH 值7.2)繼續(xù)緩速沖洗3 次，每次5 min，隨后在洗掉PEG的材料玻片上滴加適量的0.1 mol/L NH4Cl處理3 min，處理后用PBS緩沖液繼續(xù)緩速沖洗3次，每次5 min，然后滴加適量0.1%Tween 20處理20 min，最后用1%BSA處理15 min。②一抗抗體標記染色。向預(yù)處理過的樣片滴加一抗標記染液(將anti-α-tubulin抗體用PBS緩沖液稀釋100倍)，在37℃下溫育60 min，然后將經(jīng)一抗標記的材料玻片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。③二抗抗體標記染色。向清洗過的一抗標記樣片滴加二抗標記染液(將antimouse IgG FITCconjugated抗體用PBS緩沖液稀釋200倍)，并繼續(xù)在37℃下溫育60 min，此時樣片要放置于能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。處理完成后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。④復(fù)染。將免疫標記后的樣片用質(zhì)量濃度為1 mg/L的PI染色液染色1 min，隨后立即用PBS緩沖液將PI染液洗去，防止染色過量。⑤封片保存。將全部染色完成后的樣片用ATF溶液封片，-20℃保存。⑥觀察拍照。經(jīng)過免疫標記的樣片在激光共聚焦掃描顯微鏡下以494、535 nm分別檢測FITC和PI的激發(fā)熒光，并掃描觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 FITC與PI熒光相互影響情況

利用激光共聚焦顯微鏡對經(jīng)PI復(fù)染后的銀杏小孢子母細胞的微管及染色體進行觀察，結(jié)果如圖1。通過圖1a和圖1c對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PI復(fù)染后的免疫熒光標記樣片中的FITC熒光仍然能夠清晰觀察到，并未發(fā)生PI過度染色干擾FITC熒光或誤染細胞壁等情況。這說明在進行銀杏小孢子母細胞減數(shù)分裂觀察時，可以同步對FITC標記的微管蛋白和PI染色的染色體進行對比，同時觀察銀杏微管骨架和染色體在減數(shù)分裂進程中的變化及相互影響情況，由此在保證研究質(zhì)量的前提下，相對降低了研究的工作量。

另外，由于PI激發(fā)波長與FITC激發(fā)波長接近(FITC激發(fā)波長為494 nm，PI激發(fā)波長為535 nm)，大大減少了后期激光激發(fā)觀察所導(dǎo)致的熒光猝滅反應(yīng)，可有效保證圖像的質(zhì)量。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下的銀杏小孢子母細胞FITC和PI熒光圖

2.2 PEG包埋對銀杏細胞免疫活性的影響

將經(jīng)PEG包埋1 a后抗體標記的銀杏小孢子母細胞的微管結(jié)構(gòu)與對照組(固定后立即抗體標記)銀杏小孢子母細胞的微管結(jié)構(gòu)進行對比，結(jié)果如圖2。由圖2可見，經(jīng)過1 a的常溫保存，經(jīng)PEG包埋的銀杏小孢子母細胞材料內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)仍然清晰完整，與標記后立即觀察的結(jié)果相比無明顯的熒光亮度減弱現(xiàn)象出現(xiàn)。說明通過PEG包埋可以很好地保存細胞內(nèi)微管蛋白的免疫活性，長時間的包埋保存不會對其產(chǎn)生影響，為后續(xù)大批量研究觀察贏得了充足的時間。同時，由于PEG材料遇水可溶解，省去了石蠟包埋時所需的后期脫蠟步驟，包埋操作簡單，而且由于PEG材料的熔點較低，在包埋過程中所需溫度不高，大大降低了材料處理過程中溫度對銀杏細胞微管結(jié)構(gòu)的影響，保證了后期免疫標記能夠取得較好的效果。

2.3 不同粘片法的效果對比

對比2種粘片法所制樣片，發(fā)現(xiàn)經(jīng)真空粘片法所制的樣片出現(xiàn)了大量的樣品脫片情況(如圖3b和表1所示);而經(jīng)蛋清黏合劑粘的樣品未出現(xiàn)明顯的脫片情況(如圖3a和表1所示)。

圖2 固定后立即標記與PEG包埋1 a后標記的銀杏小孢子母細胞熒光對比圖

表1 不同粘片法所制樣片脫片情況對比

通過在免疫熒光檢測觀察后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)真空粘片法所制的樣片中，其銀杏小孢子母細胞的數(shù)量明顯偏少，部分樣片中只有小孢子囊結(jié)構(gòu)存在，本應(yīng)存在其中的銀杏小孢子母細胞因粘合不牢出現(xiàn)大量丟失現(xiàn)象(圖3d);而在經(jīng)蛋清黏合劑粘的樣片中，可以清晰地看到在小孢子囊結(jié)構(gòu)中有著數(shù)量眾多的銀杏小孢子母細胞存在(圖3c)。

圖3 蛋清粘合法和真空粘片法所制的銀杏小孢子母細胞切片熒光對比圖

2.4 酶解對后期免疫染色的影響

通過免疫熒光標記染色，對比無酶解處理和酶解處理后的樣品切片(圖4)。由圖4可見，經(jīng)酶解處理后樣品中的微管結(jié)構(gòu)清晰明亮(圖4a箭頭所示);同樣，未經(jīng)酶解處理的樣品中的微管結(jié)構(gòu)也依然完整，且熒光的亮度也沒有明顯降低(圖4b箭頭所示)。這說明在本試驗中由于前期的樣品處理步驟，銀杏的細胞壁已經(jīng)不會阻礙熒光標記抗體進入其細胞中發(fā)生免疫反應(yīng)，此時有無酶解處理都不會對最終觀察結(jié)果產(chǎn)生影響。所以，完全可以將免疫標記前的酶解步驟省去，從而降低試驗的成本，簡化操作步驟。

圖4 細胞壁經(jīng)酶解和未經(jīng)酶解的銀杏小孢子母細胞熒光對比圖

2.5 傳統(tǒng)壓片法與PEG包埋切片法的差異

將研究中所采用的PEG包埋切片法與傳統(tǒng)壓片法相比較后發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的壓片法制片時，樣片中銀杏細胞非常凌亂，很難將發(fā)育中銀杏小孢子母細胞和銀杏體細胞進行區(qū)分，并且采用傳統(tǒng)壓片法時樣片上會存在大量的其它組織殘留，還會伴隨有細胞大量重復(fù)疊加的現(xiàn)象出現(xiàn)，這對后期的觀察研究影響較大。而采用PEG包埋切片法時，其樣片中的銀杏細胞排列有序，PEG包埋切片完整地保持了銀杏細胞的組織結(jié)構(gòu)，能夠清晰分辨出各個細胞的種類與形態(tài)，并且沒有多余的組織殘留和細胞大量重復(fù)疊加的現(xiàn)象存在，可以對每個細胞進行清晰地觀察和研究。

圖5 傳統(tǒng)壓片法和PEG包埋切片法所制樣片熒光圖像對比

2.6 銀杏小孢子母細胞減數(shù)分裂時微管及染色體變化情況

在銀杏小孢子母細胞進入減數(shù)分裂前，其細胞核較大，占整個細胞的80%以上，其微管結(jié)構(gòu)呈放射網(wǎng)狀覆蓋于細胞核外圍四周(圖6A);當減數(shù)分裂進程處于細線期至終變期階段，細胞核內(nèi)的染色體開始變粗變短(圖6B)，此時的微管骨架結(jié)構(gòu)開始逐漸聚集于染色體四周，并開始逐漸形成早期的紡錘體(圖6C);當減數(shù)分裂進入中期I時，各對同源染色體移向細胞中央的赤道板，著絲點成對排列在赤道板2側(cè)，微管聚集在生殖細胞的兩極區(qū)域，并在細胞質(zhì)中形成了成熟的紡錘體，開始將處于中間赤道地區(qū)的染色體組向兩極牽拉(圖6D);當減數(shù)分裂進入后期I時，由于紡錘絲的牽引，使成對的同源染色體各自發(fā)生分離，并分別移向兩極，此時微管結(jié)構(gòu)以細胞兩極的極點為中心成散射狀向四周分布，在細胞兩極各自形成了一個“傘帽”(圖6E);末期I階段，由于微管的聚集，在細胞中部開始逐漸形成成膜體，細胞器逐漸聚集于成膜體的2側(cè)，中間區(qū)域的微管結(jié)構(gòu)逐漸消失，最終形成一條明顯的中間條帶(圖6F)。

在減數(shù)分裂的第二次分裂時，中期Ⅱ時細胞兩側(cè)的染色體開始逐漸聚集在兩側(cè)部分的中間區(qū)域，兩側(cè)各自形成了如中期I階段那樣的紡錘體結(jié)構(gòu)(圖6G);在后期Ⅱ階段，每條染色體的著絲點分離，兩條姊妹染色單體也隨之分開，成為2條染色體。在紡錘絲的牽引下，這2條染色體分別移向細胞的兩極;進入末期Ⅱ階段后，第2條成膜體逐漸形成，2條交叉的條帶將4組染色體分割于四分體的4個角落(圖6H)，最后形成分別由微管骨架結(jié)構(gòu)包裹的四分體(圖6I)。

3 結(jié)論與討論

自 1963 年 Ledbetter［10］和 Slautherback［11］等分別在植物和動物細胞中發(fā)現(xiàn)微管以來，微管在細胞生物學(xué)中一直是一個非常重要的研究領(lǐng)域。與動物和其它植物相比，有關(guān)木本植物微管的研究報道較少，而銀杏的微管研究目前只有Brown和Lemmon［12］曾成功采用免疫抗體標記了銀杏細胞微管組成中含量最少的γ微管蛋白，并對其在減數(shù)分裂時期的分布情況進行了跟蹤觀察，但此方法存在適用性單一、所用標記抗體昂貴、操作步驟繁瑣、樣品保存時間較短等缺點。所以，急需建立一個適用于包括銀杏在內(nèi)的木本植物細胞微管觀察的研究方法和體系，而目前公認的最好的微管觀察方法之一就是免疫熒光組織化學(xué)染色法。本研究的結(jié)果表明，采用PEG包埋切片法，并用蛋清黏合劑粘合制片，無需酶解處理，經(jīng)預(yù)處理后進行FITC免疫標記及PI復(fù)染的方法，可以獲得銀杏小孢子母細胞微管和染色體極佳的熒光圖像。與傳統(tǒng)壓片法相比，此種免疫染色方式操作簡單，所得圖像中細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，沒有細胞層間的相互干擾疊加現(xiàn)象，并且節(jié)省了傳統(tǒng)的酶解處理步驟，從而在保證標記抗體和細胞充分接觸的同時，減少了酶解處理對樣品細胞形態(tài)和微管結(jié)構(gòu)的破壞，獲得了較好的銀杏細胞微管及染色體熒光觀察結(jié)果。

由于微管在植物細胞內(nèi)有著重要的作用，所以本研究確立的最佳體系和方法可以為今后的木本植物染色體加倍、細胞內(nèi)染色體遷移、細胞壁構(gòu)建和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等方面的研究提供重要的技術(shù)參考。隨著免疫標記染色技術(shù)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入，以后的微管研究必將從靜態(tài)的觀察發(fā)展為對微管蛋白聚合—解聚這一過程的動態(tài)研究，而本文中所獲研究方法將為該方面的深入研究提供支持。

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圖6 銀杏小孢子母細胞減數(shù)分裂時期微管及染色體變化免疫熒光圖