劉朋義，別之龍

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢，430070）

嫁接換根使甜瓜接穗不直接接觸土壤中的甜瓜枯萎病菌，對(duì)甜瓜的抗病生產(chǎn)具有重要意義，因而嫁接育苗在甜瓜生產(chǎn)中逐漸得到了推廣。在生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)現(xiàn)嫁接苗有時(shí)也會(huì)感染枯萎病而死亡，但原因究竟是由于枯萎病生理小種分化所致，還是嫁接方法不當(dāng)所導(dǎo)致，目前尚無(wú)定論。此外，近年來(lái)斷根嫁接育苗技術(shù)在甜瓜生產(chǎn)上已經(jīng)得到普及，部分生產(chǎn)者擔(dān)心斷根嫁接后砧木所發(fā)生的新根可能對(duì)枯萎病抗性弱，由此對(duì)斷根嫁接苗是否抗枯萎病提出了疑問(wèn)。基于上述問(wèn)題，本研究評(píng)價(jià)了不同嫁接方法對(duì)甜瓜枯萎病抗性的影響，分析了接種病菌后嫁接苗的生理變化，以期為甜瓜的嫁接栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試接穗為伊麗莎白甜瓜（北京蔬菜研究中心提供），砧木為德高鐵柱南瓜（德高蔬菜種苗研究所選育）。

供試甜瓜枯萎病菌菌株采自武漢市蔡甸區(qū)侏儒原種場(chǎng)田間的伊麗莎白甜瓜發(fā)病植株，由中國(guó)農(nóng)科院鄭州果樹(shù)所古勤生博士課題組分離和鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

采用插接、斷根嫁接和靠接3種嫁接方法，以自根苗為對(duì)照。插接和斷根嫁接時(shí)，砧木比接穗早3 d播種；靠接時(shí)，接穗比砧木早5 d播種?？拷訒r(shí)分別在砧木子葉下1 cm（稱為靠接苗1）和2 cm（稱為靠接苗2）處進(jìn)行。在甜瓜接穗子葉剛展開(kāi)、砧木第一片真葉剛出現(xiàn)至半展開(kāi)期間嫁接。嫁接后4 d，育苗棚嚴(yán)格密封，遮光、保濕，保持白天25℃、夜間20℃。嫁接后6 d，開(kāi)始由小到大逐漸通風(fēng)煉苗，逐步過(guò)渡到正常管理?？拷?5 d時(shí)，切斷甜瓜接穗的根部。

接穗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，采用蘸根法用濃度為1×106個(gè)孢子/mL甜瓜枯萎病菌液進(jìn)行人工接種，接種后將嫁接苗定植在營(yíng)養(yǎng)杯中，每個(gè)處理接種30株，隨機(jī)排列，設(shè)3次重復(fù)[1]。接種后10 d測(cè)定病情指數(shù)、發(fā)病率，并取樣測(cè)根系活力，葉綠素含量，丙二醛（MDA）含量，相對(duì)電導(dǎo)率，POD、SOD、PAL 活力和總酚含量。

病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：莖基部無(wú)褐變；1級(jí)：莖基部褐變；2級(jí)：莖基部1/2處褐變；3級(jí)：莖基部2/3處以上褐變；4級(jí)：莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死[2]。病情指數(shù)＝100×∑（各病情等級(jí)數(shù)×該病情代表數(shù)）/（最高病情等級(jí)數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）[3]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003軟件計(jì)算數(shù)據(jù)和作圖，用SAS 8.1軟件進(jìn)行方差分析，并在5%水平采用Duncan's新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫁接方法獲得的嫁接苗的發(fā)病情況

接種甜瓜枯萎病病菌10 d后觀察發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)自根苗發(fā)病率達(dá)到73%（表1），而嫁接苗發(fā)病率為1%～2%，自根苗的病情指數(shù)為63，嫁接苗的病情指數(shù)為0.3～0.8。由以上結(jié)果可知，嫁接能夠顯著提高甜瓜對(duì)枯萎病的抗病性，而不同嫁接方法對(duì)提高甜瓜的抗枯萎病能力并無(wú)顯著差異。

表1 采用不同嫁接方法獲得的嫁接苗的發(fā)病情況

2.2 接種后根系活力和葉綠素含量變化

在接種病菌10 d后，自根苗根系活力下降很大，達(dá)71.86%，而嫁接苗根系活力并無(wú)顯著變化（圖1），不同嫁接方法的嫁接苗根系活力差異不顯著。

接種病菌10 d后，自根苗葉片的葉綠素含量顯著降低，減少了43.20%，而嫁接苗葉片的葉綠素含量無(wú)顯著變化（圖2），所以接種后嫁接苗葉片仍能維持正常光合特性。接種甜瓜枯萎病后，嫁接苗葉綠素含量顯著高于自根苗，增加幅度在45.80%～67.71%，嫁接苗葉片維持正常葉色，而自根苗葉片褪綠、枯黃。不同嫁接方法處理下，接種甜瓜枯萎病對(duì)嫁接苗葉綠素含量無(wú)顯著影響。

2.3 接種后MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率變化

在接種病菌10 d后，甜瓜自根苗根和葉片中的MDA含量均顯著高于未接種病菌的植株，其中根和葉片中MDA含量分別增加了22%和52%（圖3），說(shuō)明甜瓜自根苗接種甜瓜枯萎病菌后其細(xì)胞脂膜過(guò)氧化嚴(yán)重。但不同嫁接方法處理下，嫁接苗接種甜瓜枯萎病菌后根系和葉片中的MDA含量并無(wú)顯著差異，表明甜瓜枯萎病菌侵染后沒(méi)有對(duì)嫁接苗根系和葉片造成顯著的膜脂過(guò)氧化傷害。

接種甜瓜枯萎病菌10 d后，甜瓜自根苗根和葉片提取液的相對(duì)電導(dǎo)率分別增加了37.25%和68.75%（圖4），表明接種枯萎病菌后，自根苗根和葉片細(xì)胞膜透性增加。而采用不同嫁接方式生產(chǎn)的嫁接苗，接種枯萎病菌后根系和葉片提取液的相對(duì)電導(dǎo)率較未接種病菌的并無(wú)顯著差異，不同嫁接方法處理之間也無(wú)顯著差異。

圖1 不同嫁接方法對(duì)根系活力的影響

圖2 不同嫁接方法對(duì)葉綠素含量的影響

圖3 不同嫁接方法對(duì)甜瓜根和葉中MDA含量的影響

2.4 接種后SOD活性變化

從圖5中可以看出，接種甜瓜枯萎病菌10 d后，相對(duì)自身對(duì)照，甜瓜自根苗根中SOD活性增加了51.84%，葉片內(nèi)SOD活性增加了2倍多；嫁接苗根中SOD活性增加了65.60%～73.38%，葉片中增加了54.44%～101.81%。接種病菌10 d后，相對(duì)自根苗，嫁接苗根中SOD活性增加了28.74%～32.34%，而葉片中SOD活性減少了69.60%～92.99%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗的根和葉中SOD活性較自身對(duì)照均顯著提高，但不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中SOD活性差異不顯著。

圖4 不同嫁接方法對(duì)根和葉相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.5 接種后POD活性變化

從圖6可以看出，接種甜瓜枯萎病菌10 d后，相對(duì)自身對(duì)照，甜瓜自根苗根中POD活性增加了23.87%，葉片增加了近5倍；嫁接苗根中POD活性增加了13.69%～14.44%，插接苗葉片中增加了67.37%。接種病菌10 d后，嫁接苗相對(duì)自根苗根中POD活性增加了23.69%～32.25%，而自根苗葉片中POD活性相對(duì)嫁接苗增加了1倍多；嫁接苗葉片中POD活性相對(duì)自身對(duì)照變化不顯著，而其根中POD活性較自身對(duì)照顯著提高，但不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中POD活性差異不顯著。

2.6 接種后PAL活性和總酚含量變化

從圖7中可以看出，接種病菌10 d后，相對(duì)自身對(duì)照，甜瓜自根苗根中PAL活性增加了近1倍，葉片增加了26.94%；嫁接苗根中PAL活性相對(duì)自身對(duì)照增加了25.18%～34.75%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗根中PAL活性較自身對(duì)照顯著提高；嫁接苗相對(duì)自根苗根中PAL活性增加了1倍多。在接種病菌后只有自根苗葉片中PAL活性增加顯著，其他處理之間變化不顯著。不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中PAL活性差異不顯著。

圖5 不同嫁接方法對(duì)根和葉中SOD活性的影響

圖6 不同嫁接方法對(duì)根和葉POD活性的影響

如圖8所示，接種病菌10 d后，相對(duì)自身對(duì)照，甜瓜自根苗根中總酚含量增加了77.68%，葉片增加了41.15%；嫁接苗根中總酚含量增加了22.04%～32.34%。而相對(duì)嫁接苗，自根苗根中總酚含量增加了28.15%～40.48%，葉片總酚含量增加了54.36%～76.94%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗的根中總酚含量較自身對(duì)照顯著增加，而只有自根苗葉片中總酚含量顯著增加，嫁接處理間變化不顯著，不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中總酚含量差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同嫁接方法對(duì)甜瓜枯萎病抗性的影響

嫁接是防治枯萎病的重要措施，嫁接西瓜對(duì)枯萎病抗性明顯增強(qiáng)，且產(chǎn)量高，如砧木選用得當(dāng)，其品質(zhì)基本不受影響[4，5]。但是陳士海等[6]發(fā)現(xiàn)日光溫室內(nèi)的嫁接黃瓜有時(shí)發(fā)病率高達(dá)30%，從而認(rèn)為嫁接技術(shù)存在不足，如嫁接傷口和嫁接部位距離地面較近、黃瓜斷根不徹底等，因此提倡靠接和插接嫁接方法。孫永[7]也認(rèn)為嫁接位置太低是引起嫁接黃瓜感病的原因，同時(shí)還提出大水漫灌的灌溉方式會(huì)使嫁接部位感染病菌。本試驗(yàn)采用3種嫁接方法，并且在靠接方法上采用不同嫁接位置，結(jié)果嫁接苗均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的感病情況，并且斷根嫁接苗新生根也不會(huì)影響甜瓜對(duì)枯萎病的抗性，說(shuō)明南瓜砧木能夠抵御甜瓜枯萎病菌的侵染，嫁接方法并不是甜瓜嫁接苗感染枯萎病的主要原因。甜瓜嫁接苗受枯萎病菌侵染死亡可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)甜瓜枯萎病菌生理小種的分化。

3.2 嫁接提高甜瓜枯萎病抗性的生理機(jī)制

從本研究可以看出，接種枯萎病病菌后，甜瓜嫁接苗根系活力依然維持正常狀態(tài)，能夠?yàn)榈厣喜刻峁┓€(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)，地上部葉片的葉綠素含量也維持穩(wěn)定，能夠使植物正常生長(zhǎng)。而自根苗根系活力降低，根系嚴(yán)重受損，葉片褪綠，膜質(zhì)過(guò)氧化加劇，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起了細(xì)胞浸泡液的電導(dǎo)率增大，細(xì)胞不能維持正常生理機(jī)能，導(dǎo)致植株發(fā)生枯萎現(xiàn)象，逐漸趨于死亡。

圖8 不同嫁接方法對(duì)根和葉中總酚含量影響

植物對(duì)外界病原菌的防御體系包括其自身固有抗性和病原菌誘導(dǎo)抗性2種。其中病原菌誘導(dǎo)抗性是細(xì)胞在受病菌侵染后，通過(guò)改變自身結(jié)構(gòu)和內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)改變酶活性而增強(qiáng)抵御病菌能力。本試驗(yàn)中植株接種病菌后，根系和葉片中SOD、POD、PAL活性均升高，用以清除活性氧、催化壁中的大分子物質(zhì)交聯(lián)以加強(qiáng)壁的結(jié)構(gòu)或修復(fù)受損的壁，同時(shí)還產(chǎn)生酚類物質(zhì)抑制病菌。嫁接苗根中保護(hù)酶活性要高于自根苗，而葉中保護(hù)酶活性變化較小，說(shuō)明嫁接苗根系在抗病中起到重要作用，而自根苗根系已經(jīng)受病菌嚴(yán)重侵害，植物組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，使得酶活降低。徐勝利等[8]發(fā)現(xiàn)嫁接西瓜生育中后期根系中PAL活性顯著高于自根苗，認(rèn)為PAL與根系抗病關(guān)系密切。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)嫁接苗根中PAL活性顯著高于自根苗，此外，嫁接苗根系中的SOD和POD活性也顯著高于自根苗。接種病菌10 d后，嫁接苗地上部酶活性變化不明顯，可能是由于病菌被限制在嫁接苗根中，地上部沒(méi)有受到病菌侵染；而自根苗地上部酶活性顯著增加，且顯著高于嫁接苗，表明自根苗根系無(wú)法阻止病菌對(duì)地上部的侵染，從而使得地上部細(xì)胞必須通過(guò)生理生化變化來(lái)抵御病菌脅迫。

酚類物質(zhì)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，能夠抑制病原菌的擴(kuò)展。本試驗(yàn)中接種病菌10 d后，自根苗根系和葉片內(nèi)酚類物質(zhì)大量增加，表明植物受到病菌嚴(yán)重侵害，生成酚類物質(zhì)以抑制病菌。大量的酚類物質(zhì)也可能導(dǎo)致植物本身受到很大的傷害，雖然嫁接苗中酚類物質(zhì)也有少量增加，但不足以對(duì)植物產(chǎn)生抑制作用。

許勇等[9]對(duì)抗感不同的西瓜接種枯萎病菌后發(fā)現(xiàn)，抗病品種中的POD、PAL活性顯著高于感病品種，并且與木質(zhì)素和富含羥脯氨酸糖蛋白（HRGP）含量的變化協(xié)同，根莖部增加量大于葉片的增加量。魏岳榮等[10]發(fā)現(xiàn)香蕉的抗病品種抗枯5號(hào)根部和葉部酚類物質(zhì)的含量都顯著高于感病品種并且抗感品種的葉部酚類物質(zhì)含量均高于根部。

本試驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，嫁接苗在枯萎病菌脅迫下能夠通過(guò)砧木根系內(nèi)在的生理變化提高嫁接苗植株對(duì)病菌的抗性，可能主要是通過(guò)抗氧化系統(tǒng)和PAL活性的提高來(lái)抵御枯萎病菌侵染后所致的膜脂過(guò)氧化傷害，維持根系和葉片的正常生理功能。

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