王 東 ， 宋 君 ， 尹 全 ， 陶 李 ， 雷紹榮 ，劉 勇

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（成都），四川 成都 610066）

0 引 言

隨著近年生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，大豆、玉米、棉花、油菜等100多個(gè)轉(zhuǎn)基因作物品種已經(jīng)商業(yè)化種植[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，由轉(zhuǎn)基因作物加工生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因食品約達(dá)4000種[2（]其中豆制品最多），包括部分食用油、醬油、番茄醬、薯?xiàng)l（片）、玉米片、漢堡包等。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全問題，雖然一直受到世界各國(guó)政府和公眾的極大關(guān)注[3]，但目前沒有科學(xué)證據(jù)表明食用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)身體有害。目前很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)管理，因此，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)鑒定已成為各主要貿(mào)易國(guó)的一項(xiàng)重要工作[4]。

在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA分離純化過程中，三氯甲烷和乙醇往往不能完全除盡而成為后期PCR反應(yīng)的抑制劑。迄今，關(guān)于三氯甲烷和乙醇這2種有機(jī)試劑在轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)中的抑制作用未見報(bào)道。該文以抗除草劑（CP4-EPSPS）轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）為研究材料，模擬三氯甲烷和乙醇在反應(yīng)體系中的殘留，探討這2種有機(jī)試劑的殘留量對(duì)Lectin基因擴(kuò)增的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

抗除草劑（CP4-EPSPS）轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2，購(gòu)自歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和計(jì)量研究所（institute for reference materials and measurements，IRRM）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的分離純化

采用GB/T 19495.3-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法》附錄C中CTAB法提取DNA[5]。

1.2.2 Lectin基因擴(kuò)增

采用GB/T 19495.4-2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法》的引物和反應(yīng)條件[6]。擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)標(biāo)基因Lectin引物序列，former：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3′，reverse：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。擴(kuò)增條件：預(yù)變性為95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)為95℃20s，60℃ 40s，72℃ 40s，共 40 個(gè)循環(huán)；延伸為 72℃3min。

1.2.3 三氯甲烷殘留的PCR反應(yīng)體系

25 μL反應(yīng)體系，各成分終濃度為2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4 μmol/L，DNA 模板 2 ng/μL，三氯甲烷摩爾濃度梯度見表1，最后補(bǔ)充滅菌超純水至總體積25 μL。

表1 三氯甲烷摩爾濃度梯度表

1.2.4 乙醇?xì)埩舻腜CR反應(yīng)體系

25 μL反應(yīng)體系，各成分終濃度為2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4μmol/L，DNA 模板 2ng/μL，乙醇濃度梯度見表2，最后補(bǔ)充滅菌超純水至總體積25 μL。

表2 乙醇摩爾濃度梯度表

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯甲烷對(duì)PCR反應(yīng)抑制

轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2內(nèi)標(biāo)基因Lectin的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未加三氯甲烷時(shí)，內(nèi)標(biāo)基因Lectin正常擴(kuò)增，設(shè)置的空白對(duì)照正常，說明反應(yīng)體系能正常工作，實(shí)驗(yàn)條件無污染。在25 μL反應(yīng)體系中，逐次增加三氯甲烷的含量，其PCR反應(yīng)受到的抑制作用也相應(yīng)增強(qiáng)，直至PCR反應(yīng)完全受到抑制。電泳結(jié)果顯示如圖1所示，在25 μL反應(yīng)體系中，三氯甲烷的含量在 1～5 μL（0.50～2.51 mol/L）時(shí)，條帶信號(hào)（亮度）逐漸減弱，但信號(hào)衰減不明顯，表明PCR對(duì)三氯甲烷的耐受性較強(qiáng)，三氯甲烷對(duì)PCR有一定的抑制作用，但并不明顯；當(dāng)加入6～7μL（3.02～3.52 mol/L）三氯甲烷時(shí)，條帶信號(hào)（亮度）衰減明顯，說明PCR擴(kuò)增反應(yīng)在3.02～3.52 mol/L濃度范圍內(nèi)受到三氯甲烷明顯的抑制作用；在反應(yīng)體系中，當(dāng)三氯甲烷含量達(dá)到 7.5 μL（3.77 mol/L）時(shí)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)被徹底抑制。

圖1 三氯甲烷對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用

2.2 乙醇對(duì)PCR反應(yīng)抑制

當(dāng)未加乙醇時(shí)，設(shè)置的對(duì)照正常，說明轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2內(nèi)標(biāo)基因Lectin的擴(kuò)增體系和實(shí)驗(yàn)條件符合實(shí)驗(yàn)要求。添加乙醇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的PCR反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用，其抑制程度隨乙醇濃度的增加而加大。在25μL反應(yīng)體系中，當(dāng)乙醇?xì)埩袅课闯^1μL（0.70mol/L）時(shí)，與不含乙醇的對(duì)照反應(yīng)體系相比，擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)衰減不明顯，PCR反應(yīng)受到的抑制作用較弱（圖2）；當(dāng)乙醇?xì)埩袅砍^1μL（0.70mol/L）時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)衰減明顯，PCR反應(yīng)受到的抑制作用明顯增強(qiáng)；25 μL 反應(yīng)體系中乙醇?xì)埩袅窟_(dá)到 2μL（1.39mol/L）時(shí)，PCR反應(yīng)幾乎完全受到抑制；超過此濃度時(shí)，則PCR徹底被抑制。

圖2 乙醇對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用

3 討 論

對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)主要是基于核酸的PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的PCR檢測(cè)技術(shù)是國(guó)際認(rèn)可的首選方法?；诔Ｒ?guī)PCR的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)具有實(shí)驗(yàn)流程長(zhǎng)、中間步驟多、易污染等特點(diǎn)。雖然轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)發(fā)展較為成熟，但仍然存在很多問題，尤其是未商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的檢測(cè)以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品DNA的分離與純化，這2個(gè)問題已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的瓶頸。

目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類多、數(shù)量大。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，一般都要經(jīng)過若干道加工程序，原料的理化性質(zhì)發(fā)生很大變化，營(yíng)養(yǎng)成分重新搭配同時(shí)引入了各種添加劑，在很大程度上增加了DNA分離與純化的難度。常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品DNA的分離與純化方法主要有酚-三氯甲烷法、PVP法、CTAB法、硅土法、胍-三氯甲烷法等，其中三氯甲烷和乙醇是常用的2種有機(jī)試劑。乙醇易溶于水，DNA是水溶性物質(zhì)，在DNA抽提中乙醇不易完全揮發(fā)，所以在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的后續(xù)PCR反應(yīng)中往往殘留了一定量的乙醇。三氯甲烷幾乎不溶于水（25℃時(shí)，僅0.5%體積分?jǐn)?shù)），但是由于在水相和有機(jī)相的分離、轉(zhuǎn)移過程中，DNA水溶液中往往混合了少量的三氯甲烷。高質(zhì)量（高濃度、高純度）的DNA是PCR反應(yīng)正常工作的首要條件，不含或者低含量的乙醇和氯仿等有機(jī)試劑的DNA模板直接影響轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的成敗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)體系中存在的三氯甲烷摩爾濃度≥3.77 mol/L時(shí)，則會(huì)徹底抑制PCR的進(jìn)行；和三氯甲烷相比，乙醇對(duì)PCR的抑制作用非常大，當(dāng)在體系中加入1.39 mol/L的乙醇，就能使大部分DNA聚合酶失活從而抑制PCR反應(yīng)，降低擴(kuò)增效率。因此，在轉(zhuǎn)基因食品DNA提取過程中，要特別注意轉(zhuǎn)移DNA水相時(shí)不要吸到有機(jī)相，以免給后續(xù)步驟殘留更多的有機(jī)試劑。在轉(zhuǎn)基因食品DNA提取過程中，應(yīng)多次純化，最大限度地減少三氯甲烷等有機(jī)試劑在核酸中的殘留。由于乙醚具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，所以在轉(zhuǎn)基因食品DNA純化中，為了徹底除去DNA水溶液中殘留的三氯甲烷等有機(jī)試劑，可以加入少量的乙醚幫助溶解三氯甲烷等有機(jī)試劑，最后揮發(fā)完全。在DNA提取中乙醇的完全去除也是很關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。乙醇是DNA熱聚合酶（蛋白質(zhì)）的變性劑，PCR反應(yīng)體系中乙醇的殘留將會(huì)降低擴(kuò)增反應(yīng)效率或者抑制擴(kuò)增反應(yīng)，所以在DNA純化完畢后應(yīng)盡可能去除乙醇。

4 結(jié)束語(yǔ)

對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法主要是以針對(duì)外源蛋白的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法和以外源基因?yàn)閷?duì)象的DNA檢測(cè)方法兩大類。因DNA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性較高和適用范圍相對(duì)較大，所以在實(shí)際檢測(cè)工作中常用DNA檢測(cè)方法[7]。高質(zhì)量的DNA是保證轉(zhuǎn)基因檢測(cè)準(zhǔn)確的關(guān)鍵和前提，因此，在DNA的分離和純化過程中，應(yīng)盡量減少三氯甲烷和乙醇等有機(jī)試劑的殘留，最大可能地減少它們對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用。

[1] 賈士榮.轉(zhuǎn)墓因作物的安全性爭(zhēng)論及其對(duì)策[J].生物技術(shù)通報(bào)，1999（6）：1-7.

[2] James C.2002 Global review of commercialized transgenic crops[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.isaaa.org，2002.

[3] Office of Food Additive Safety.U.S.food and drug administration[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.fdacfsan/biotech-nology.

[4] 宋君，王東，劉勇，等.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)存在的問題及建議[J].中國(guó)測(cè)試，2009，6（35）：88-90.

[5] GB/T 19495.3—2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[6] GB/T 19495.4—2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[7] 邵碧英，陳文，江樹勛，等.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法概述[J].生物技術(shù)通報(bào)，2004，5（15）：516-518.