高碧霞，李明喜，劉雪嬌，蔡建芳，樊曉紅，楊嘯林，李雪梅，李學(xué)旺

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1腎內(nèi)科 2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100730 3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100005

代謝綜合征 (metabolic syndrome，MS)是一組以胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ)的代謝紊亂癥候群［1］。研究顯示MS是慢性腎臟疾病 (chronic kidney disease，CKD)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但目前尚缺乏MS早期腎損害生物標(biāo)志物及診斷方法的研究［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在篩選疾病生物標(biāo)志物方面具有廣闊的發(fā)展前景［2］。納米磁珠聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)是近年發(fā)展較快的一項(xiàng)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，有研究應(yīng)用該技術(shù)探討腎小球疾病尿液多肽譜，發(fā)現(xiàn)不同腎小球疾病呈現(xiàn)各自獨(dú)特的尿液多肽表達(dá)譜，提示該技術(shù)可作為尋找腎臟疾病尿液潛在標(biāo)志物的有效手段［3］。本研究采用弱陽(yáng)離子交換磁珠 (magnetic bead-based weak cation exchange chromatography，MB-WCX)聯(lián)合MALDI-TOF-MS建立MS早期腎損害尿液蛋白譜并尋找疾病潛在尿液標(biāo)志物。

對(duì)象和方法

對(duì)象 來(lái)源于2008至2009年北京平谷地區(qū)“MS腎臟損害”流行病學(xué)研究［4］，入選者留取8h過(guò)夜尿液標(biāo)本，女性留尿避開月經(jīng)期，標(biāo)本收集當(dāng)日避免劇烈運(yùn)動(dòng)和飲酒。采樣前均簽署知情同意書。

方法 入選者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，同文獻(xiàn) ［4］。入選和排除標(biāo)準(zhǔn):入選者分為MS無(wú)腎臟損害組和MS早期腎臟損害組。MS按照美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃的成人治療專家組Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。MS早期腎損害符合以下兩個(gè)條件［5］:(1)20μg/min≤尿白蛋白排泄率 ＜ 200μg/min;(2)由簡(jiǎn)化“腎臟病膳食改良試驗(yàn)”公式［6］計(jì)算的腎小球?yàn)V過(guò)率 (estimated glomerular filtration rate，eGFR)≥60 ml/(min·1.73 m2)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)高血壓3級(jí):兩次測(cè)量血壓平均值收縮壓≥180和 (或)舒張壓≥110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);(2)血尿及膿尿:尿沉渣鏡檢白細(xì)胞≥5個(gè)/高倍鏡視野或紅細(xì)胞≥3個(gè)/高倍鏡視野;(3)其他慢性腎臟疾病、泌尿系結(jié)石、慢性肝炎及近期泌尿系統(tǒng)感染病史。

MB-WCX富集尿液蛋白 采用MB-WCX試劑盒(德國(guó)Bruker Daltonics公司)進(jìn)行尿液蛋白的分離和富集，具體步驟參考文獻(xiàn) ［7］。

MALDI-TOF-MS建立質(zhì)譜圖 應(yīng)用UltrafleX-tremeTMⅢ MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀 (德國(guó)Bruker Daltonics公司)建立尿液蛋白譜圖，步驟如下:(1)點(diǎn)靶:參考文獻(xiàn) ［7］;(2)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集:采用正離子線性模式，參數(shù)設(shè)置如下:第一離子源20.0 kV，第二離子源18.5 kV，以1000 Hz氮激光照射，激光能量35% ～45%，檢測(cè)范圍為質(zhì)荷比1000～15000。每個(gè)標(biāo)本點(diǎn)3個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)多點(diǎn)采集共累積500次建立質(zhì)譜圖。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性評(píng)估和質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性評(píng)估方法見參考文獻(xiàn) ［6］。數(shù)據(jù)采集前每6個(gè)靶點(diǎn)取1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品 (德國(guó)Bruker Daltonics公司)進(jìn)行質(zhì)譜儀質(zhì)量校準(zhǔn)，分子質(zhì)量的誤差范圍＜0.1%。

生物信息學(xué)軟件處理

譜圖處理:ClinProTools(CRT)2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖譜處理，包括基線平滑、衰減、過(guò)濾掉信噪比＜5的峰等，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和歸一化處理。

差異蛋白峰的篩選及模型構(gòu)建:有兩種方法。(1)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法聯(lián)合遺傳算法 (genetic algorithm，GA):以峰面積作為質(zhì)荷比蛋白峰的量化指標(biāo)，Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)CRT軟件內(nèi)置的GA算法對(duì)上述差異蛋白峰進(jìn)行篩選并構(gòu)建診斷模型。采用10倍交叉驗(yàn)證對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。(2)隨機(jī)森林 (random forest，RF)聯(lián)合支持向量機(jī) (support vector machine，SVM):質(zhì)譜數(shù)據(jù)同譜圖處理，通過(guò)RF篩選差異蛋白峰，以蛋白峰“mean decrease in accuracy”作為評(píng)估每個(gè)蛋白峰在分類中重要性的標(biāo)準(zhǔn)，重要性＞0.005的峰作為差異蛋白峰;利用SVM(LibSVM2.88)對(duì)差異蛋白峰構(gòu)建診斷模型，核函數(shù)采用徑向基核函數(shù)，通過(guò)網(wǎng)格搜索和10倍交叉驗(yàn)證優(yōu)化模型，確定SVM參數(shù)C=2.65，gamma=2－14.5時(shí)模型分類性能最佳。繪制受試者工作特征曲線并計(jì)算曲線下面積。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

平均譜圖的建立 入選者包括MS無(wú)腎損害患者54例和 MS早期腎損害患者46例，性別、年齡、eGFR兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尿白蛋白排泄率在MS早期腎損害組顯著高于MS無(wú)腎臟損害組 (P＜0.05)(表1)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)性評(píng)估通過(guò)計(jì)算變異系數(shù)為7.7%～23.0%。應(yīng)用CRT軟件進(jìn)行譜圖處理，建立兩組樣本尿液平均蛋白譜圖 (圖1)。

圖1 MS無(wú)腎臟損害組 (紅色)和MS早期腎臟損害組 (綠色)的平均尿液蛋白圖譜Fig 1 Average urinary protein spectra of MS without renal injury(red)and MS with early renal injury(green)

差異蛋白峰的篩選 應(yīng)用Wilcoxon檢驗(yàn)分析兩組平均尿液蛋白譜圖，在相對(duì)分子質(zhì)量1000～15000內(nèi)，38個(gè)蛋白峰表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，其中20個(gè)蛋白峰在MS早期腎損害組高表達(dá);應(yīng)用 RF算法顯示“mean decrease in accuracy”重要性＞0.005的蛋白峰14個(gè)，12個(gè)蛋白峰在MS早期腎損害組表達(dá)上調(diào)，這12個(gè)蛋白峰中有11個(gè)亦是Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的差異蛋白峰 (表2)。

診斷模型的建立和評(píng)估 GA算法篩選5個(gè)蛋白峰構(gòu)建診斷模型，其中3個(gè)蛋白峰 (質(zhì)荷比2756.98、9077.04和10054.26)在MS早期腎損害組表達(dá)上調(diào)。該模型對(duì)MS早期腎損害診斷敏感性為82.6%、特異性為84.3%、準(zhǔn)確性為83.5%。RF算法篩選14個(gè)差異蛋白峰應(yīng)用于SVM算法構(gòu)建診斷模型 (表2)，此模型對(duì)MS早期腎損害診斷敏感性為89.2%、特異性為81.1%、準(zhǔn)確性為85.5%。對(duì)RF聯(lián)合SVM構(gòu)建模型繪制受試者工作特征曲線，曲線下面積為0.91(圖2)。兩個(gè)模型中共有的蛋白峰包括質(zhì)荷比2756.98、3019.11、9077.04和10054.26，其中質(zhì)荷比2756.98、9077.04和10054.26在MS早期腎損害患者尿液中高表達(dá) (表2、3)。

表1 MS無(wú)腎損害和MS早期腎損害患者臨床資料Table 1 Clinical data of metabolic syndrome patients without/with renal injury

表2 RF-SVM算法構(gòu)建診斷模型中的蛋白峰Table 2 Depiction of protein peaks in RF-SVM-based diagnostic model

表3 GA構(gòu)建診斷模型中的蛋白峰Table 3 Depiction of protein peaks in GA-based model

圖2 SVM分類器構(gòu)建診斷模型的受試者工作特征曲線Fig 2 Receiver operating characteristic curve of SVM-based diagnostic model

討 論

隨著生活方式的改變，MS發(fā)病率逐年升高［1］。研究顯示MS是CKD獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，對(duì)MS腎臟損害早期診斷和干預(yù)對(duì)改善相關(guān)腎臟疾病的長(zhǎng)期預(yù)后具有重要的意義［1］。目前微量白蛋白尿和eGFR下降是MS早期腎臟損害的主要臨床指標(biāo)，有些糖尿病患者出現(xiàn)微量白蛋白尿并不進(jìn)展為臨床蛋白尿，而eGFR下降是所有CKD患者病情進(jìn)展的表現(xiàn)。針對(duì)MS早期腎臟損害迄今尚無(wú)較好的臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

臨床蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。尿液是最容易得到的體液，主要反映腎臟、膀胱及全身其他系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)，其收集方法獲取簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)，蛋白質(zhì)/多肽含量豐富，是較好的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究資源，特別適合腎臟疾病生物標(biāo)志物的研究［8］。尿液蛋白質(zhì)組學(xué)常用的技術(shù)包括二維凝膠電泳、液相色譜聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜 (liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LCMS/MS)以及表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS) 技 術(shù)［9］。SELDI-TOF-MS技術(shù)通過(guò)載有不同配基的芯片捕獲小分子蛋白/多肽，靈敏度高達(dá)飛摩爾，作為一項(xiàng)高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)一定程度上彌補(bǔ)了二維凝膠電泳和LC-MS/MS的不足，但該技術(shù)重復(fù)性欠佳，不能直接鑒定差異蛋白［10］。2004年出現(xiàn)的Clinprot系統(tǒng)應(yīng)用球形納米磁珠富集蛋白，和蛋白芯片相比，由于結(jié)合表面積增大，捕獲的小分子蛋白/多肽的種類更多，敏感性和準(zhǔn)確性更高;聯(lián)合高靈敏度的MALDI-TOF質(zhì)譜儀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性得到了提高，在臨床大樣本研究中更具優(yōu)勢(shì)［11］;可聯(lián)合LC-MS/MS鑒定高豐度的小分子蛋白/多肽［12］。

在尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，樣本的收集和處理是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵。Fiedler等［7］通過(guò)研究尿液收集、儲(chǔ)存等方法的不同對(duì)磁珠富集尿液中蛋白及多肽的影響，建立了磁珠分離尿液蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化流程。本研究在尿液標(biāo)本的收集和處理過(guò)程中借鑒上述標(biāo)準(zhǔn)化流程，規(guī)范從流調(diào)樣本采集、運(yùn)送、處理以及存儲(chǔ)各個(gè)環(huán)節(jié)，最大程度上避免人為因素對(duì)標(biāo)本中蛋白含量的影響;每個(gè)樣本凍融1次;采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量校正，保證校正的平均相對(duì)分子質(zhì)量偏差＜0.01%;在數(shù)據(jù)采集方面，每例制備好的尿液標(biāo)本在靶上重復(fù)3個(gè)點(diǎn)，對(duì)同一靶點(diǎn)的不同結(jié)晶點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)采集。得到的變異系數(shù)較好，保證了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

本研究采用WCX磁珠聯(lián)合UltrafleXtremeTMⅢMALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀建立了MS無(wú)腎損害和MS早期腎損害患者尿液蛋白譜圖。通過(guò)CRT軟件內(nèi)置的Wilcoxon檢驗(yàn)篩選出20個(gè)蛋白峰在 MS早期腎臟損害患者尿液中高表達(dá);應(yīng)用RF算法篩選出12個(gè)蛋白峰在MS早期腎臟損害組尿液中高表達(dá)，其中11個(gè)蛋白峰也是Wilcoxon檢驗(yàn)結(jié)果中的差異峰，提示這11個(gè)差異蛋白峰可能作為MS早期腎損害尿液診斷標(biāo)記物的候選蛋白。目前尚無(wú)應(yīng)用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索MS早期腎臟損害診斷標(biāo)記物的研究，Gianazza等［12］采用C8磁珠聯(lián)合MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)糖尿病腎病和正常人血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究，聯(lián)合LC-MS/MS鑒定纖維蛋白肽A在糖尿病腎病患者血清高表達(dá)。本研究室下一步通過(guò)磁珠富集目標(biāo)蛋白，應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)候選蛋白進(jìn)行序列鑒定。

機(jī)器學(xué)習(xí)分類方法已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)中質(zhì)譜數(shù)據(jù)的模型構(gòu)建，模型通過(guò)多個(gè)特征峰的聯(lián)合檢測(cè)代替單一特征峰，提高了疾病診斷的敏感性和特異性。在多種機(jī)器學(xué)習(xí)分類方法中SVM和RF對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分類能力最好，且RF在數(shù)據(jù)特征點(diǎn)選擇方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［13］。本研究在差異峰的選擇和診斷模型的構(gòu)建中，除了采用CRT軟件內(nèi)置的GA算法，還將RF聯(lián)合SVM算法應(yīng)用Clinprot系統(tǒng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。采用多種機(jī)器分類方法構(gòu)建的兩個(gè)模型共同包含了質(zhì)荷比2756.98、3019.11、9077.04和10054.26個(gè)蛋白峰，結(jié)果具有較好的一致性，交叉驗(yàn)證評(píng)估兩個(gè)模型對(duì)MS早期腎損害診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均較好，下一步可增加臨床樣本量對(duì)診斷模型加以驗(yàn)證。

綜上，本研究應(yīng)用WCX磁珠分離結(jié)合MALDITOF-MS分析MS早期腎損害尿液蛋白譜圖，采用多種機(jī)器學(xué)習(xí)分類方法篩選出MS早期腎臟損害的尿液差異蛋白峰，并建立了具有較好識(shí)別率的診斷模型。下一步將進(jìn)一步進(jìn)行差異蛋白峰的序列鑒定和驗(yàn)證。

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