張瑩瑩，李俊岑，饒瑩，楊拯，張曉，鄭蕖，許麗麗

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是嚴(yán)重危害人類健康的脊柱脊髓疾患，常致嚴(yán)重傷殘，引起各種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生存質(zhì)量，甚至危及生命。脊髓損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，膠質(zhì)瘢痕形成與炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是加重神經(jīng)損傷和功能障礙的主要原因。電刺激在脊髓功能恢復(fù)中具有一定的促進(jìn)作用，但電刺激對SCI后炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕形成的影響報道較少。電刺激是否有助于減輕SCI后膠質(zhì)瘢痕形成和炎癥反應(yīng)呢？

神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)參與膠質(zhì)瘢痕形成過程；白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1 alpha,IL-1α)為主要的炎癥因子，其表達(dá)的增加是加重炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的主要因素之一。為此，本實驗以GFAP、IL-1α為觀察指標(biāo)，探討電刺激對大鼠脊髓損傷后不同時段損傷區(qū)及附近GFAP、IL-1α表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠72只，雌雄不限，體重(180±20)g，由四川大學(xué)實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃。隨機(jī)分為損傷組(n=24)、電刺激組(n=24)和正常組(n=24)。損傷組和電刺激組于造模后l d、3d、5 d、7 d分成4小組，每小組6只。

1.2 動物模型制備 損傷組和電刺激組大鼠均用1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，背部剃毛，常規(guī)消毒。以T9為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9椎板，按Allen's法[1]用自行加工設(shè)計的打擊裝置，將10 g沖擊棒自25 mm高處自由墜落致傷脊髓?？p合傷口。正常組大鼠僅切除相應(yīng)椎板后即縫合傷口。術(shù)后大鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)。協(xié)助大鼠排尿，每日早晚各1次，至其排尿反射恢復(fù)；每日注射青霉素1 ml和生理鹽水2 ml，抗菌和補(bǔ)充體液，持續(xù)至大鼠取材。在此期間注意觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛。

1.3 電刺激 術(shù)后24 h起對電刺激組大鼠進(jìn)行經(jīng)皮電刺激30 min，每天1次。參數(shù)設(shè)置：疏密波脈沖電流，電流強(qiáng)度中檔，刺激頻率10 Hz，正極接T7右側(cè)夾脊穴位置的皮膚，負(fù)極接右下肢足三里穴位置的皮膚。連續(xù)電刺激至各組動物取材。

1.4 取材及切片處理 各組大鼠分別在術(shù)后1 d、3d、5 d、7 d取材。用過量的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，自左心室插管后剪開右心耳，灌注加入肝素鈉與普魯卡因的冰生理鹽水，直到有澄清液從右心耳流出，再灌注4%多聚甲醛1 h。打開椎弓管，切除T7、T9、T11段脊髓，固定24 h后置自動脫水包埋機(jī)處理。修片，連續(xù)切片，片厚5μm，連續(xù)5張進(jìn)行貼片、烤片，備用。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 采用非生物素二步法進(jìn)行GFAP和IL-1α免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫臘，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復(fù)，用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加GFAP抗體(1∶500)或IL-1α抗體(1∶20)，4℃冰箱過夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min。加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應(yīng)，顯微鏡下顯色充分，及時用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復(fù)染，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察GFAP、IL-1α的表達(dá)，陽性結(jié)果為棕黃色反應(yīng)。

1.6 大鼠后肢運(yùn)動功能觀察 按照Basso[2]等報道的BBB(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale)運(yùn)動功能評分方法進(jìn)行評定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 用OLYMPUS數(shù)碼照像機(jī)采集圖像，觀察GFAP、IL-1α陽性產(chǎn)物在脊髓的分布。分別計數(shù)各組術(shù)后1 d、3d、5 d、7 d脊髓內(nèi)、中、外3個視野1028μm2面積內(nèi)GFAP、IL-1α的陽性細(xì)胞數(shù)，測量陽性產(chǎn)物的平均積分光密度值。各組陽性細(xì)胞數(shù)和平均積分光密度值數(shù)據(jù)以(±s)表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 損傷前，3組大鼠BBB評分均為21.00分；損傷后，損傷組、電刺激組BBB評分均小于正常組(P＜0.05)；從損傷后第5天開始，電刺激組BBB評分高于損傷組(P＜0.05)。見表1。

表1 脊髓損傷后不同時間點各組大鼠BBB評分的比較(n=6)

2.2 GFAP 正常組脊髓中央管周圍的室管膜區(qū)未見GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)；室管膜區(qū)以外的灰質(zhì)和白質(zhì)中偶可見染色程度較弱的GFAP陽性細(xì)胞；GFAP陽性細(xì)胞突起細(xì)長并向四周延伸。損傷1 d后，損傷組和電刺激組可觀察到脊髓損傷區(qū)、損傷鄰近區(qū)、中央管周圍室管膜區(qū)、灰質(zhì)和白質(zhì)中GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)(圖1)；損傷3d后，在損傷區(qū)及周圍灰質(zhì)、白質(zhì)中GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)與損傷后1 d相比均增多(P＜0.05)，GFAP陽性細(xì)胞肥大，染色變深；損傷3～5 d，GFAP陽性細(xì)胞逐漸達(dá)到高峰；5 d時損傷組和電刺激組的積分光密度值均達(dá)到最高，損傷組高于電刺激組(P＜0.05)(圖1，表2)；損傷7 d后，電刺激組和損傷組GFAP陽性細(xì)胞較7 d時減少(圖1)。與損傷組相比，電刺激組變化幅度較小。見表2、表3。

表2 損傷后不同時間點大鼠GFAP平均積分光密度值(n=6)

表3 損傷后不同時間點大鼠GFAP陽性細(xì)胞數(shù)(n=6)

2.3 IL-1α正常組脊髓灰質(zhì)前角附近有極少量IL-1α陽性細(xì)胞。損傷組損傷后1 d，脊髓灰質(zhì)前角可見少量IL-1α陽性細(xì)胞，呈IL-1α弱染色的突起(圖2)；隨著時間的推移，IL-1α表達(dá)量呈遞增趨勢(圖2)，至損傷后7 d，在灰質(zhì)前角區(qū)可見大量的IL-1α免疫反應(yīng)陽性物(圖2)，并表達(dá)量達(dá)峰值。電刺激組損傷后1 d和3d，IL-1α陽性表達(dá)變化較少(圖2)，5 d后表達(dá)量稍有增加(圖2)，7 d后表達(dá)量有明顯增加(圖2)。損傷后5 d、7 d時，電刺激組IL-1α的平均積分光密度值低于損傷組(P＜0.05)。見表4、表5。

表4 損傷后不同時間點大鼠IL-1α平均積分光密度值(n=6)

表5 損傷后不同時間點大鼠IL-1α陽性細(xì)胞數(shù)(n=6)

2.4 GFAP和IL-1α在電刺激組中的相關(guān)性 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對電刺激組中GFAP和IL-1a的陽性細(xì)胞數(shù)的平均積分光密度值進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，GFAP和IL-1α在1～7 d的變化相關(guān)(r=0.891,P＜0.05)。

3 討論

GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要骨架蛋白之一，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種特征性標(biāo)記物[3]。GFAP表達(dá)的減少反映星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性減弱[4]。星形膠質(zhì)細(xì)胞一方面能提供特殊的軸突再生促進(jìn)因子或誘導(dǎo)因子，促進(jìn)或誘導(dǎo)軸突再生；另一方面也可產(chǎn)生阻礙軸突再生的抑制因子或形成局部瘢痕[5-9]。

電刺激能在局部形成“微電池”效應(yīng)，加速局部代謝，改善局部缺血微環(huán)境[10-11]，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)組織的再生與修復(fù)，減輕脊髓的繼發(fā)性損傷[12]。

本實驗結(jié)果顯示，在電刺激組和損傷組中，脊髓損傷后1～3d，GFAP陽性表達(dá)無顯著性差異，但星形膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠脊髓損傷后1 d開始活化，1～3d增殖緩慢，這可能與脊髓損傷早期主要表現(xiàn)為局部水腫、出血和組織細(xì)胞發(fā)生水解壞死，而膠質(zhì)細(xì)胞處于活化初期有關(guān)；損傷后5 d兩組GFAP陽性表達(dá)到高峰，而損傷后7 d，GFAP陽性細(xì)胞減少，在這兩個時間點，電刺激組GFAP表達(dá)低于損傷組，提示損傷后5 d可能是電刺激影響星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖的關(guān)鍵時間點。

IL-1α是在感染和炎癥狀態(tài)下，由多種細(xì)胞產(chǎn)生的、具有多方面生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，主要參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[13-14]。IL-1α表達(dá)減少提示炎癥反應(yīng)的減弱。有實驗表明，電針督脈可以通過抑制脊髓水腫的程度來減輕脊髓的繼發(fā)性損傷[15]；在缺血性腦損傷大鼠，電針明顯抑制大鼠腦組織炎癥反應(yīng)，減輕缺血再灌注繼發(fā)性神經(jīng)元損傷，對腦缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用[16]。本實驗結(jié)果提示，電刺激可能能抑制受損傷脊髓組織中的IL-1α表達(dá)，減輕脊髓損傷后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

本實驗提示，脊髓損傷后，GFAP和IL-1α的表達(dá)存在相關(guān)性。有文獻(xiàn)報道，星形膠質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌神經(jīng)活性物質(zhì)[17]；而炎癥因子的釋放可導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而反射性促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)瘢痕形成[18]。兩者之間存在一定聯(lián)系。

脊髓繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上觸發(fā)的一系列多種分子和細(xì)胞參與的復(fù)雜過程，對這一過程本質(zhì)的認(rèn)識對于控制繼發(fā)性損傷，促進(jìn)脊髓再生修復(fù)具有重要意義[19-20]。本研究提示，電刺激在短期內(nèi)能減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，降低炎癥因子，創(chuàng)造了有利于運(yùn)動功能的恢復(fù)及神經(jīng)再生的微環(huán)境。但長期電刺激治療的療效情況仍不清楚。

[1]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column:A preliminary report[J].JAm MedAssoc,1911,57:878-880.

[2]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC,et a1.MASCIS evaluation of open field locomotor scores:effect of experience and teamwork on reliability multieenter animal spinal cord injury study[J].J Neurotrauma,1996,13(7):343-359.

[3]Eng LF,Yu ACH,Lee YL.Astrocytic response to injury.Progress in brain research[J].Res Neurol Neurosci,1992,94(4):353-365.

[4]Carmignoto G.Astrocyte-neurone crosstalk:variants of the same language[J].Trends Pharmacol Sci,2000,21(7):252-258.

[5]Bezzi P,Volterra A.A neuron-glia signalling network in the active brain[J].Curr Opin Neurobiol,2001,11(3):387-394.

[6]Fitch MT,Doller C,Combs CK,et al.Cellular and molecular mechanisms of glial scarring and progressive cavitation:in vivo and in vitro analysis of inflammation-induced secondary injury afterCNS trauma [J].JNeurosci,1999,19(19):8182-8198.

[7]Schiffer D,Giordana MT,Migheli A,et al.Glial fibrillary acidic protein and vimentin in the experimental glial reaction of the rat brain[J].Brain Res,1986,374(1):110-118.

[8]Eng LF,Ghirnikar RS,Lee YL.Glial fibrillary acidic protein:GFAP-thirty-one years(1969-2000)[J].Neurochem Res,2000,25(9-10):1439-1451.

[9]Kigerl KA,McGaughy VM,Popovich PG.Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury[J].J Comp Neurol,2006,494(4):578-594.

[10]Kerr C,McDowell B,Cosgrove A,et a1.Electrical stimulation in cerebral palsy:a randomized controlled trial[J].Dev Med Child Neural,2006,48(11):870-876.

[11]Fehlings MG,Tator CH.The effect of direct current field polarity on recovery after acute experimental spinal cord injury[J].Brain Res,1992,579(1):32-42.

[12]牛曉梅,劉智斌,牛文民,等.督脈、夾脊電針治療急性脊髓損傷實驗研究進(jìn)展分析[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,(3):53-56.

[13]Pan JZ,Ni L,Sodhi A,et al.Cytokine activity contributes to induction of inflammatory cytokine mRNAs in spinal cord following contusion[J].J Neurosci Res,2002,68(3):315-322.

[14]Yamazaki Y,Maeda T,Someya G,et al.Temporal and spatial distribution of Fos protein in the lumbar spinal dorsal horn neurons in the rat with chronic constriction injury to the sciatic nerve[J].Brain Res,2001,914(1-2):106-114.

[15]韓清民,謝杰,柴生颋,等.電針督脈對實驗性脊髓損傷大鼠水通道蛋白24的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(7):736-739.

[16]周爽,黃建華.電針對腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)的影響[J].江蘇中醫(yī)藥,2005,26(7):49-51.

[17]王紅,張遠(yuǎn)強(qiáng),丁玉強(qiáng),等.神經(jīng)激膚p受體在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位分布[J].解剖學(xué)報,2002,33(1):21.

[18]Puder BA,Papka RE.Hypothalamic paraventricular axons projecting to the female rat lumbosacral spinal cord contain oxytocin immunoreactivity[J].J Neurosci,2001,64(1):53-60.

[19]Turner RS,Delong MR.Corticostriatal activity in primary motor cortex of the macaque[J].J Neurosci,2000,20(18):7096-7108.

[20]Hamid S,Hayek R.Role of electrical stimulation for rehabilitation and regeneration after spinal cord injury:an overview[J].Eur Spine J,2008,17(9):1256-1269.