韓明，袁芳，董麗萍，師忠芳，袁輝，楊少華

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤(簡稱“膠質(zhì)瘤”)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見而又最難治的腫瘤，手術(shù)后的有效化療是目前治療惡性膠質(zhì)瘤、延長患者生命的必要手段之一[1]。但是，由于膠質(zhì)瘤化療耐藥現(xiàn)象十分常見，化療效果并不理想，因此提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性是膠質(zhì)瘤化療亟須解決的重要問題。BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞是我所80年代由1例人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級)細(xì)胞培養(yǎng)建立的細(xì)胞系[2]，為國內(nèi)學(xué)者研究人腦膠質(zhì)瘤常用的細(xì)胞系之一[3-4]。但是，目前缺乏該細(xì)胞系對臨床常用抗腫瘤藥物敏感譜的研究，本實(shí)驗(yàn)選用簡便、準(zhǔn)確性高的cell-countykit-8(CCK-8)法，檢測BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞對順鉑(cisplatin,DDP)、替尼泊甙(teniposide,VM26)、尼莫斯汀(nimustine,ACNU)、替莫唑胺(temozolomide,TMZ)及長春新堿(vincristine,VCR)5種臨床常用抗腫瘤藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦多形性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系BT325：北京市神經(jīng)外科研究所儲存。試劑與儀器：DMEM：GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；培養(yǎng)板：Costar公司；DDP：齊魯制藥有限公司；ACNU：日本三共株式會社；VM26：百時美施貴寶；TMZ：江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司；VCR：廣州明興制藥有限公司；CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Sunrise酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮凍存的BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞，40℃～42℃水溫迅速融化后1000 r/min離心10 min，去上清，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打分散為細(xì)胞懸夜，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 細(xì)胞生長曲線測定 取已鋪滿BT325細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，用終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化后吹打分散為單細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，接種密度為5×104個/ml。按DMEM培養(yǎng)基中FBS的濃度將BT325細(xì)胞分為3組，分別為無血清組、10%FBS組、20%FBS組。每24小時取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)6 d，以細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，按Patterson公式計(jì)算細(xì)胞倍增時間為：

Td=tlg2/lg(Nt/No)

其中Td：倍增時間(h)；t：細(xì)胞數(shù)由No增至Nt所需的時間；No：接種時的細(xì)胞數(shù)；Nt：培養(yǎng)th后的細(xì)胞數(shù)。

1.4 GFAP免疫組化染色 BT325細(xì)胞丙酮固定，免疫組織化學(xué)染色。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，GFAP抗體稀釋濃度為1∶100，DAB顯色。

1.5 抗腫瘤藥物的敏感性實(shí)驗(yàn) 用終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化BT325細(xì)胞，以5×104個/ml的密度接種于96孔板，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，每孔100μl，24 h后每孔分別加入10μl抗腫瘤藥物。每種藥物7個濃度，按照血漿峰濃度(plasma peak concentration,PPC)進(jìn)行倍比稀釋，DDP、VM26、ACNU、TMZ及VCR的PPC分別為：2.5μg/ml，5 μg/ml，6.5 μg/ml，7 μg/ml及0.5 μg/ml。藥物作用72 h后，每孔加10μl CCK-8試劑，2 h后酶標(biāo)儀在492 nm處測吸光度(OD值)。

1.6 藥物抑制率計(jì)算

抑制率=[1-(As-Ab)/(Ac-Ab)]×%

As：實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑、抗腫瘤藥物)OD值；Ac：對照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑、無抗腫瘤藥物)OD值；Ab：空白孔(無細(xì)胞和抗腫瘤藥物、有CCK-8試劑)OD值。

抑制率≥50%為敏感，抑制率≥70%為高度敏感，IR＜50%認(rèn)為不敏感。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件波茲曼方程分析藥物的量效關(guān)系，計(jì)算IC50。應(yīng)用方差分析比較各組細(xì)胞倍增時間的差異。

2 結(jié)果

2.1 不同血清濃度培養(yǎng)的BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)觀察及生長曲線 BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞貼壁生長，倒置相差顯微鏡下觀察，BT325細(xì)胞半透明，形態(tài)呈多形性，包括梭形、星形、多角形，折光性好，無血清組及10%FBS組BT325細(xì)胞生長狀態(tài)較好(圖1A、B)，而20%FBS組BT325細(xì)胞增殖過快，6 d時細(xì)胞因密度過大出現(xiàn)死亡(圖1C)。細(xì)胞生長曲線顯示接種第2天3組BT325細(xì)胞均進(jìn)入對數(shù)生長期，第5天細(xì)胞增殖達(dá)到高峰，并且20%FBS組第6天出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量下降(圖2)。無血清、10%FBS及20%FBS組的BT325細(xì)胞倍增時間分別為：(25.63±1.93)h、(19.53±3.56)h、(18.83±3.69)h，方差分析顯示僅無血清組與20%FBS組差異有顯著性(P＜0.05)，其他組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 BT325細(xì)胞鑒定 GFAP免疫組化染色可見，BT325細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，在胞漿內(nèi)可見褐色染色(圖1D)。

2.3 BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性 采用含10%FBS DMEM培養(yǎng)的BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤藥物敏感性的測定。DDP對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用明顯，在0.625×PPC濃度時抑制率達(dá)到51.8%，在1.25×PPC濃度時抑制率達(dá)到75.1%，且呈劑量依賴性，IC50為0.560×PPC。VM26在與其他藥物相同的濃度梯度時對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制明顯，各濃度抑制率均在79%以上，未顯示出明確量效關(guān)系；進(jìn)一步擴(kuò)大藥物稀釋梯度后，VM26對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，顯示出量效關(guān)系，IC50為0.063 PPC(圖3)。VCR對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞有抑制作用，抑制率為(48.71±11.64)%～(52.68±8.03)%，與藥物濃度無關(guān)。ACNU及TMZ在所觀察的藥物劑量范圍內(nèi)抑制率均在34%以下，對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞基本無抑制作用。見表1。

圖1 BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長狀況

圖2 BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長曲線

圖3 VM26對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞的量效關(guān)系

表1 不同藥物對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率(%)

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤患者平均生存時間短，手術(shù)及放療都不能治愈，化療個體差異大，治療效果不十分理想[5]，因此研究膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制對提高化療效果有重要的臨床意義。因膠質(zhì)瘤的手術(shù)標(biāo)本不易得到，培養(yǎng)有一定難度，應(yīng)用人源的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行抗腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥機(jī)制研究受到關(guān)注[6]。本所建立的人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系BT325[2]，生物學(xué)性能穩(wěn)定，增殖快，細(xì)胞形態(tài)多樣，是研究腫瘤耐藥機(jī)制、篩選抗腫瘤藥物的理想靶細(xì)胞。由于膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)觀察了BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞對5種臨床常用的、作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物敏感性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BT325細(xì)胞對DDP敏感，對VM26高度敏感，對ACNU、TMZ不敏感，VCR有抑制作用但無量效關(guān)系。該結(jié)果與我們用人腦膠質(zhì)瘤組織培養(yǎng)化療藥物敏感性檢測得到的結(jié)果及文獻(xiàn)報道相似[7-10]。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的抗腫瘤藥物按照作用機(jī)制可以分為3類：①藥物作用與DNA烷基化無關(guān)的DDP及VM26；②通過DNA烷基化損傷發(fā)揮作用的ACNU及TMZ；③作用于M期的周期特異性藥物VCR。DDP為金屬鉑的絡(luò)合物，是臨床治療實(shí)體瘤的重要藥物，與烷化劑形成的鏈間交聯(lián)不同，90%的鉑與DNA結(jié)合形成鏈內(nèi)交聯(lián)，阻止DNA合成，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。VM26是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，通過導(dǎo)致DNA雙鏈或單鏈破壞，使細(xì)胞阻滯于晚S期或早G2期，為細(xì)胞周期特異性藥物，不引起DNA烷基化。本實(shí)驗(yàn)觀察到BT325細(xì)胞對DDP及VM26均敏感，從藥物的作用機(jī)制分析該敏感性與DNA烷基化無關(guān)。相反，ACNU及TMZ都是烷化劑類藥物，通過DNA烷基化損傷，形成DNA交聯(lián)，抑制DNA合成，引起細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是目前臨床上首選的膠質(zhì)瘤治療藥[11-12]。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BT325細(xì)胞對ACNU及TMZ都不敏感，提示該細(xì)胞系可能代表臨床部分患者對ACNU及TMZ治療不敏感的情況，可用于研究ACNU及TMZ的耐藥機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥性的方法。VCR是細(xì)胞周期特異性藥物，作用于有絲分裂的M期，干擾紡錘絲和微管蛋白的合成，使有絲分裂停止于中期，引起腫瘤細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到VCR對BT325細(xì)胞活性的抑制作用與藥物濃度無關(guān)，推測可能與本實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞群中處于M期細(xì)胞的數(shù)目固定有關(guān)。結(jié)果還提示臨床上應(yīng)用VCR時要考慮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞動力學(xué)特點(diǎn)，單獨(dú)增加VCR的劑量并不能提高療效。

作為一種新型的體外細(xì)胞活性檢測方法，CCK-8法比4-甲基偶氮唑鹽(MTT)法更具優(yōu)勢[13]。CCK-8試劑中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此酶標(biāo)儀檢測得到的吸收度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。由于反應(yīng)生成物為水溶性甲臜，可直接進(jìn)行比色，操作簡單，重復(fù)性好。而以往細(xì)胞活性檢測多用MTT法測定，反應(yīng)生成物非水溶性甲臜顆粒有溶解不完全、結(jié)果重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，而且操作較繁瑣。目前CCK-8法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。

值得一提的是，由于細(xì)胞培養(yǎng)基中血清濃度對培養(yǎng)細(xì)胞的生長、增殖影響較大，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞活性檢測時，一定要考慮該因素對檢測結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20%FBS組，由于細(xì)胞增殖過快，接種第6天時BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量的死亡細(xì)胞，這些死亡細(xì)胞會干擾細(xì)胞活性的測定結(jié)果，因此選擇合適的FBS濃度也是保證細(xì)胞活性測定準(zhǔn)確的關(guān)鍵因素之一。

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