楊 巍，李廣興,孟凡丹,王 鑫，任曉峰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030）

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種接觸性腸道傳染病[1]。常以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬的高致死率為主要特征。PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)[2]。其基因組是單股正鏈的并且具有感染性的RNA，全長為28 033 nt，在基因組的5′端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)(Cap)，3′端有一個(gè)Poly(A)尾。PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白與其他冠狀病毒相似，該病毒有糖基化纖突蛋白（Spike）、糖基化囊膜蛋白（Membrane）和與RNA結(jié)合的未糖基化核衣殼蛋白（N蛋白）三種[3]。其中N蛋白是由441個(gè)氨基酸組成的，分子質(zhì)量為55～58 ku之間的磷酸化的核衣殼蛋白。N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占的比例最大，在感染的細(xì)胞中能夠得到大量的表達(dá)。在感染PEDV的早期，動(dòng)物體內(nèi)就能夠產(chǎn)生抗N蛋白的較高水平的抗體，而且N蛋白的保守性很高，所以利用PEDV的N蛋白為基礎(chǔ)來建立PEDV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）在黑龍江省某豬場分離。

1.1.2 細(xì)胞

Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑和工具菌

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP Miture、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制劑購自Sigma公司；DNA回收試劑盒購自南京凱基公司。PET-30a、感受態(tài)菌TG1、BL21等由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的分離與鑒定

1.2.1.1 PEDV的分離

由黑龍江某豬廠采取的患病豬糞便樣品用PBS按10倍稀釋，研碎充分混勻。將研碎的內(nèi)溶物混合液離心(10 000 r·min-1，15 min，4 ℃)去除較大的沉淀物，然后取上清液二次離心 (10 000 r·min-1，15 min，4℃)徹底去除沉淀物。將上清液用無菌濾膜除菌分儲(chǔ)存于-70℃冰箱備用。

1.2.1.2 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）RNA的提取

取上清液3 mL，用PEG法濃縮病毒，即加入等體積預(yù)冷的20%的PEG8000（1 mol·L-1NaOH溶解），反復(fù)顛倒數(shù)次，室溫放置30 min（或4℃過夜）。室溫12 000 r·min-1離心5 min，棄去上清。加入100 μL滅菌水（DEPC水）重懸病毒粒子。參照試劑盒說明書用試劑盒提取RNA。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成病毒cDNA[5-6]。

反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL體系）如下：d H2O 2.75 μL；MgCl2（25 mmol·L-1）2 μL；5 × MLV Buffer 2 μL；dNTP 1 μL；RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.25 μL；M-MLV 0.5 μL；樣品 RNA 1 μL；特異性下游引物P2 0.5 μL。

反應(yīng)條件為：42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，然后將產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 基因片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)登錄號為DQ355224基因序列設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

上游(P1)：5′TGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAA 3′

下游(P2)：5′CGGTCTAACATTGTTTAATTTCC 3′

RT-PCR 體系（25 μL）如下：10×Ex-Taq Buffer 2.5 μL；Ex-Taq 0.25 μL；P1（上游引物） 0.5 μL；P2（下游引物）0.5 μL；cDNA 5 μL；d H2O 16.25 μL。

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，54.4℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，72℃終延伸10 min，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定。

1.2.2 豬流行性腹瀉病毒N基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將上述的PCR產(chǎn)物膠回收后與PMD18-T載體16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli TG1中并均勻涂在A+抗性的LB平板上。24 h后菌落PCR鑒定。然后將初步鑒定的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。最后將初步鑒定為陽性的菌液進(jìn)行測序[7-8]。根據(jù)測序結(jié)果的基因序列設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行N基因的亞克隆，引物中劃線的部分分別為插入的Bam HⅠ和Hind III酶切位點(diǎn)。

上游(N1)：5′GGATCCATGCCTCTTAGGGTT 3′

下游(N2)：5′AAGCTTGATTTCCTGTATCGAA 3′

RT-PCR 體系如下：10×Ex-Taq Buffer 2.5 μL；Ex-Taq 0.25 μL；P1（上游引物）0.5 μL；P2（下游引物）0.5 μL；cDNA 5 μL；d H2O 16.25 μL。將 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與PET-30a載體分別用Bam HⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切、常規(guī)轉(zhuǎn)化篩選陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中經(jīng)RT-PCR鑒定構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為PET-30a-PEDV-N/BL21[9]。

1.2.3 重組的豬流行性腹瀉病毒N蛋白的表達(dá)

將重組的PET-30a-PEDV-N/BL21菌液進(jìn)行活化，加入終濃度為0.5 mmol·mL-1IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。加入IPTG后用1.5 mL EP管每隔1 h取一管菌液，共取7 h。將收集到的菌液4℃、12 000 r·min-1離心5 min收集沉淀。每管沉淀用20 μL的PBS懸起后加入等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水煮10 min，用于SDS-PAGE電泳分析。1.2.4 豬流行性腹瀉病毒的細(xì)胞培養(yǎng)

生長良好的Vero單層細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS液清洗2次，將分離的病毒上清液與含2%胎牛血清的DMEM按10%的比例進(jìn)行混合接種于細(xì)胞瓶內(nèi)，并加入不含EDTA的胰酶，使混合液中胰酶的終濃度為50 μg·mL-1。在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，之后加入含終濃度50 μg·mL-1胰酶維持液的DMEM(含2%血清)，37℃培養(yǎng)，逐日觀察，72 h為一個(gè)傳代周期。傳代前細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片后同樣方法進(jìn)行傳代。整個(gè)過程中都設(shè)有不接種病毒并含有同樣濃度胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)物作對照[10]。

1.2.5 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）全病毒多克隆抗體的制備

將大量細(xì)胞培養(yǎng)的病毒超離純化，然后測定病毒的濃度，調(diào)整病毒的濃度達(dá)到2 mg·mL-1[11]。取1 mL病毒與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，采用皮下多點(diǎn)注射到兔子背部進(jìn)行免疫。兩周后，調(diào)整病毒濃度為1 mg·mL-1，取1 mL病毒與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化經(jīng)皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔7 d加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行4次。最后一次免疫后一周，頸動(dòng)脈無菌取血。血液在37℃放置2 h后，轉(zhuǎn)入4℃放置過夜，次日無菌收集血清，分裝后于-40℃保存[12]。

1.2.6 多克隆抗體及重組蛋白的特異性檢測

用Western blot的方法檢測重組的N蛋白的生物學(xué)活性[13]。試驗(yàn)樣品為重組的PEDV的N蛋白，以及誘導(dǎo)后的空載體。二抗為山羊抗兔的HRPIgG。用DAB顯色進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 N基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定

利用RT-PCR方法擴(kuò)增出PEDV的N基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析與預(yù)期大小一致，約為1 400 bp（見圖1）。DNA測序表明該基因與參考毒株序列同源性在90%以上，基因大小為1 326 bp，并獲得GenBank登錄號（GU321197），其編碼氨基酸序列（441 aa）（見圖2）。將重組質(zhì)粒PET-30a-PEDV-N進(jìn)行雙酶切及PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析與預(yù)期的目的片段大小相符（結(jié)果見圖3和4）, 表明基因克隆成功，重組質(zhì)?？捎糜谡T導(dǎo)表達(dá)蛋白。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplifying N gene

圖2 PEDV HLJBY株N基因編碼的氨基酸序列Fig.2 Deduce amino acids of PEDV isolate HLJBY N gene

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組的PET-30a-PEDV-N/BL21菌液經(jīng)IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析顯示誘導(dǎo)后的菌體蛋白與未誘導(dǎo)的對照菌以及誘導(dǎo)后的空載體菌相比較，有一條非常明顯的蛋白表達(dá)帶。并且隨表達(dá)時(shí)間的增加蛋白的濃度增大（見圖5）。參照分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白大小約為54 ku，與預(yù)測的目的蛋白大小一致，證明該重組質(zhì)粒在大腸桿菌中得到了表達(dá)。Western blot證實(shí)該蛋白可與抗全病毒多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖3 重組質(zhì)粒PET-30a-PEDV-N的單雙酶切結(jié)果Fig.3 Enzyme digestion of PET-30a-PEDV-N

圖4 PET-30a-PEDV-N/BL21重組菌的菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4PCRofPET-30a-PEDV-N／BL21transformedbacteria

圖5 PET-30a-PEDV-N／BL21重組菌的蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expression of PEDV N protein

2.3 豬流行性腹瀉病毒的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

定的中和的能力，因此TGEV對歐洲豬群的危害目前沒有PEDV嚴(yán)重[16]。相對比，TGEV和PEDV對包括中國在內(nèi)的亞洲國家的豬群均有較大的潛在威脅，特別是目前有關(guān)PEDV流行病學(xué)、病毒致病特性、診斷預(yù)防等相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究首要目的是特性一株我們實(shí)驗(yàn)室近來分離的PEDV地方分離株（HLJBY）在細(xì)胞上的培養(yǎng)特性，并通過PCR和基因克隆技術(shù)分子鑒定該毒株。

1988年,Hofmann等首次在培養(yǎng)基中含胰酶的Vero細(xì)胞上成功繁殖了PEDV[10]，試驗(yàn)中仍采用相似的技術(shù)分析PEDV HLJBY株的細(xì)胞感染特性，致細(xì)胞病變（CPE）分析表明該毒株能很快適應(yīng)Vero細(xì)胞，盲傳8代以后即可出現(xiàn)典型的CPE。該細(xì)胞適應(yīng)株的獲得可為病毒大量繁殖及為可適用于現(xiàn)地

彩圖版ⅠA為正常Vero細(xì)胞，細(xì)胞保持致密單層呈長梭形，輪廓清晰，細(xì)胞脫落極少。彩圖版IB為被PEDV病毒感染的Vero細(xì)胞，細(xì)胞開始圓縮，脫落，細(xì)胞間空隙加大，最后大量細(xì)胞脫落拉成網(wǎng)狀，表明該病毒已經(jīng)適應(yīng)Vero細(xì)胞，可進(jìn)行連續(xù)傳代。

3 討論

PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均屬于造成仔豬腹瀉的重要I群動(dòng)物冠狀病毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13-15]在歐洲的豬群中近年來出現(xiàn)了一個(gè)TGEV的一個(gè)呼吸道變異株（PRCV）的廣泛感染。由于感染PRCV豬的血清對TGEV有一免疫的疫苗研制提供了重要基礎(chǔ)。

PEDV的N蛋白在病毒RNA合成過程中發(fā)揮著重要的作用，它能與細(xì)胞膜和磷脂結(jié)合，促進(jìn)病毒的組裝和RNA復(fù)制體的形成。并且N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占的比例最大，在感染的細(xì)胞中能得到大量表達(dá)。豬在感染PEDV的早期體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體。因此我們利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了PEDV HLJBY株的N基因。測序結(jié)果表明擴(kuò)增的產(chǎn)物含N基因完整開放閱讀框，通過序列測定在分子水平上證實(shí)了我們分離的病毒為PEDV。同時(shí)通過基因融合技術(shù)，成功構(gòu)建了PET-30a-PEDV-N重組質(zhì)粒；在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)建立了高效表達(dá)N蛋白的原核表達(dá)體系，獲得了大量的N蛋白，為PEDV功能研究提供了重要實(shí)驗(yàn)材料。隨后我們將PEDV在Vero細(xì)胞上大量繁殖后超離純化，作為免疫原制備了兔抗PEDV的多克隆抗體血清。Western-blot顯示原核表達(dá)重組蛋白能與PEDV全病毒多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)說明重組蛋白和多抗血清具有較好的生物學(xué)活性，為建立新的PEDV檢測方法奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分離了一PEDV地方流行株HLJBY，并將該分離株通過連續(xù)多次盲傳后使其適應(yīng)在Vero細(xì)胞上增殖。利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了含PEDV N基因的重組DNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在該外源表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了PEDV N蛋白。通過超速離心的方法將PEDV進(jìn)行純化，用純化后的全病毒作為抗原免疫家兔，通過抗體測定實(shí)驗(yàn)表明純化后的PEDV可作為良好的免疫原制備高免血清。通過蛋白電泳分離PEDV N蛋白后，用抗PEDV多克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)的PEDV N蛋白與抗PEDV多克隆抗體有良好的免疫反應(yīng)性。

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