李德軍，劉運楓，周曉玲，郭定宗

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，哈爾濱 150010；3.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070）

子宮內(nèi)膜炎是奶牛最為常見的一種產(chǎn)科疾病，是引起奶牛不孕的重要原因之一，特別是患有隱性子宮內(nèi)膜炎的奶牛，由于沒有明顯的臨床癥狀，大多數(shù)情況下都延誤了最佳治療時機，導致患牛因久治不育而被淘汰，給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。

正常情況下，子宮通過機械性保護屏障和免疫功能阻止和消滅侵入的病原體，以維持正常生理活動的進行。一旦這兩種防御體系受到破壞，就會發(fā)生子宮內(nèi)的炎癥過程。子宮具有區(qū)別于其他器官的防御機制，但非特異性免疫和特異性免疫仍然是子宮免疫反應(yīng)的兩大主要類型。病原菌侵入機體要通過兩道屏障：第一道屏障即子宮的物理排除能力，若細菌突破這道防線，就會遇到第二道防線即子宮內(nèi)膜中分布的免疫細胞如巨噬細胞、自然殺傷細胞和T淋巴細胞及由他們分泌的細胞因子，從而激發(fā)了免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫球蛋白[2]。本研究通過對血液中淋巴細胞亞型（CD4+、CD8+）、血液和子宮分泌物中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）的含量變化的監(jiān)測，探討患子宮內(nèi)膜炎的奶牛特異性防御系統(tǒng)的變化過程。

1 材料與方法

1.1 試驗動物的選擇及分組

在某大型奶牛場選擇膘情良好，沒有外傷、乳房炎、營養(yǎng)代謝不良等疾病及未經(jīng)抗生素治療的3～8歲產(chǎn)后表現(xiàn)健康的荷斯坦奶牛，分別于產(chǎn)后7、14、21、28、35、42、49 d 七個時間點進行血液及子宮分泌物的采集。并在21 d時對實驗牛的陰道分泌物進行檢查，將陰道內(nèi)有粘液膿性和膿性分泌物排出的奶牛作為臨床型子宮內(nèi)膜炎組（CE），共有30頭；將陰道分泌物中中性粒細胞大于18%作為亞臨床型子宮內(nèi)膜炎組（SE），共有28頭；將陰道分泌物中中性粒細胞小于18%作為對照組（N），共有10頭[3]。

1.2 血液樣品的采集及處理

肝素抗凝血1 mL，緩慢加入含有等體積的淋巴細胞分離液的離心管中，1 500 r·min-1，離心15 min。小心吸取中間白膜層，加入PBS，1 500 r·min-1，離心10 min，重復2次，制成淋巴細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106個·mL-1。取1 mL細胞懸液，1 000 r·min-1，離心10 min，棄上清。加入100 μL PBS懸浮細胞。將細胞懸液加入已含有10 μL特異性FITC標記的CD4+或CD8+抗體的塑料離心管，4℃孵育30 min，洗滌2次。加入300 μL PBS，避光，1 h內(nèi)上BD FACS Calibur流式細胞儀進行檢測。

另取2 mL非抗凝血，水浴30 min，4 000 r·min-1，離心5 min，取血清，按照濰坊三維生物工程集團有限公司檢測免疫球蛋白（IgG/IgA/IgM）的試劑盒進行測定。

1.3 子宮分泌物樣本的采集及處理

消毒外陰，借助開口器，將含有20 mL滅菌乳酸林格氏液的子宮清洗器送入子宮體內(nèi)，通過直腸內(nèi)的另一只手將子宮內(nèi)的液體由子宮體移到子宮角進行反復沖洗。然后用一個長60 cm的硬質(zhì)塑料管將分泌物吸出，取一滴滴于載玻片上，風干、染色、鏡檢；剩余部分貯存于無菌試管中，-20℃保存?zhèn)溆谩y定方法同血液樣本。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS for Windows 6.12軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中CD4+、CD8+細胞變化

CE組血液中CD4+百分數(shù)除第14天外，其他各時間點均極顯著高于對照組（P＜0.01）。SE組在產(chǎn)后第7和第21天時與對照組比差異極顯著（P＜0.01），其他時間點均無顯著性差異（P＞0.05）。CE組和SE組比較，僅在28和49 d時存在顯著性差異（P＜0.01)(見圖 1） 。

圖1 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD4+百分數(shù)變化Fig.1 Percentage change of CD4+T cells in blood of cows with endometritis

CE組CD8+百分數(shù)與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。SE組在第28、35和42天時與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），除第21天無顯著性差異外（P＞0.05)，其他各時間點表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD8+百分數(shù)變化Fig.2 Percentage change of CD8+T cells in blood of cows with endometritis

2.2 血液中CD4+/CD8+變化

由圖3可知，SE組和CE組CD4+/CD8+比值顯著低于對照組，SE組CD4+/CD8+比值高于CE組。

2.3 血液和子宮分泌物中IgG、IgA、IgM濃度的變化

從表1可見，SE組和CE組IgG濃度極顯著低于N組（P＜0.01)。SE組和CE組變化比較在21和35 d時無顯著性差異（P＞0.05)。

三組IgA濃度變化雖然較緩慢，但SE、CE組與N組間均存在極顯著性差異（P＜0.01)。SE組變化較其余兩組顯著，在產(chǎn)后28 d時，IgA的濃度有所降低，隨后很快又呈升高趨勢。

CE組血清中IgM濃度極顯著低于N組（P＜0.01)，產(chǎn)后第49天時達到峰值。SE組血清中IgM濃度產(chǎn)后第2周有所下降，之后又開始回升，升高幅度極顯著高于CE組，且在產(chǎn)后第6周時，濃度值高于N組。

圖3 子宮內(nèi)膜炎奶牛血液中CD4+/CD8+比值的變化Fig.3 Ratio Change of CD4+/CD8+in blood of cows with endometritis

表1 子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中IgG、IgA、IgM濃度的變化Table 1 Concentration change of IgG,IgA,IgM in serum of cows with endometritis （mg·mL-1）

表2 子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物中IgG、IgA、IgM濃度的變化Table 2 Concentration change of IgG、IgA、IgM in uterine secretion of cows with endometritis （mg·mL-1）

由表2可知，SE組和CE組子宮分泌物中，IgA和IgM的濃度變化高于N組，而IgG的濃度變化沒有規(guī)律性。SE組和CE組子宮分泌物中IgG濃度變化呈上升趨勢，在產(chǎn)后頭3周均低于N組，之后CE組極顯著高于對照組（P＜0.01)，SE組也在產(chǎn)后第35天開始與對照組存在顯著性差異（P＜0.05)。

3 討論

3.1 子宮的細胞免疫防御機制

健康、未孕的動物子宮內(nèi)最主要的白細胞亞型是T淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞，其中T淋巴細胞主要是CD4+(輔助型)、CD8+(細胞毒素型)和CD2+亞群，這些細胞的遷移和分布，在子宮局部免疫中起著重要作用。T細胞亞群能反映宿主免疫調(diào)節(jié)能力，CD4+/CD8+比值更能反映宿主細胞免疫狀態(tài)，為預(yù)后提供參考。當局部體液免疫應(yīng)答的作用受到限制時，細胞免疫在子宮免疫防御方面就變得很重要[4]。T淋巴細胞是細胞免疫和體液免疫的重要環(huán)節(jié)，能在抗原刺激下活化產(chǎn)生功能各異的淋巴因子，調(diào)節(jié)體液免疫[5]。

本試驗結(jié)果表明，SE組血液中CD4+比例顯著升高；CD8+細胞呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，說明感染初期，CD4+和CD8+T淋巴細胞均被活化，但CD4+細胞被活化的程度比CD8+明顯，所以CD4+/CD8+比值也呈現(xiàn)升高趨勢。說明SE組輔助性T淋巴細胞的作用要強于細胞毒性T淋巴細胞的作用，此時機體的免疫力主要由輔助性T淋巴細胞激活細胞因子，產(chǎn)生大量可以中和抗原的抗體。輔助性T淋巴細胞還可以誘導T和B淋巴細胞在局部淋巴結(jié)的增殖。這些淋巴細胞隨后遷移到子宮內(nèi)膜作為細胞介導和抗體介導的免疫應(yīng)答的效應(yīng)器。

而CE組血液中CD4+、CD8+細胞比例變化的波動，決定了CD4+/CD8+比值呈現(xiàn)相應(yīng)的變化。說明CE組產(chǎn)后以輔助T淋巴細胞的作用為主，接著CD8+被活化激活后，抑制了CD4+的作用，從而機體表現(xiàn)免疫力降低，但在產(chǎn)后第7周后，機體又開始逐漸恢復到原來的水平。

3.2 子宮的體液免疫防御機制

產(chǎn)后生殖道疾病的發(fā)展在很大程度上取決于奶牛本身的天然抵抗力。而且依賴于局部子宮的免疫機制。而了解這一機制，就要研究IgS的水平和分泌。一些研究已經(jīng)證明了牛子宮分泌物中有Ig存在并且具有抵抗感染的作用，本試驗對子宮分泌物中三種免疫球蛋白的檢測結(jié)果也說明了這點。這些免疫球蛋白可作為調(diào)理素增強吞噬作用來直接溶解細菌或者刺激補體途徑來完成對細菌的消滅作用[6-7]。

本試驗結(jié)果表明，三種免疫球蛋白在血中和子宮分泌物中的含量各不相同。血液中主要以IgG、IgM為主，IgA含量很少。而子宮分泌物中，主要以IgG和IgA為主，IgM占少數(shù)。說明當炎癥發(fā)生時，子宮分泌物中IgA的量超過了IgM的生成量，此結(jié)果表明IgA在炎癥過程中，除由外周血中轉(zhuǎn)入子宮腔內(nèi)外，還可由子宮粘膜進行表達，這也證明了當炎癥發(fā)生后，子宮粘膜的局部免疫發(fā)揮著主要的作用，這與Pierce研究的結(jié)果相似[8]。

本試驗中，子宮分泌物IgA和IgM的含量在炎癥過程中呈現(xiàn)降低趨勢，而IgG呈現(xiàn)升高變化，這與Kowald等的報道不完全相同，這可能是由于IgG除了可由子宮內(nèi)膜合成外，還可由血液轉(zhuǎn)運而來，而IgA和IgM主要由子宮內(nèi)膜合成，由于子宮內(nèi)膜受損導致二者的生成減少[9-10]。Butt等經(jīng)過試驗證明，子宮中多數(shù)IgG2和一半IgG1來自血清。由此可見，當子宮發(fā)生炎癥時，機體會動員免疫防御系統(tǒng)來參與免疫應(yīng)答[11]。

4 結(jié)論

通過本試驗我們發(fā)現(xiàn)，當CD4+/CD8+比值降低時，血液中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA） 的含量呈升高趨勢，說明細胞免疫降低時，體液免疫正在加強，機體通過對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來抵御炎癥反應(yīng)的過程。

[1] 史同瑞.奶牛子宮內(nèi)膜炎研究新進展[J].中國奶牛,2006(6):36-40.

[2] 賈杏林，齊長明.奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志,2005(2):43-45.

[3] Kasimanickam R,Duffield T F,Foster R A,et al.Endometrial cytology and ultrasonography for the detection of subclinical endometritis in postpartum dairy cows[J].Theriogenology,2004,62:9-23.

[4] MesteckyJ,MoldoveanuZ,Russell M W.Immunological uniqueness of the genital tract:challenge for vaccine development[J].American Journal of Reproductive and Immunology,2005,53:208-214.

[5] Sato S.Immunosuppression in periparturient cows and the effects of immunostimulation[J].Tohoku J Veterinary Clnics,1998,21:61-70.

[6] Dhaliwal G S,Murray R D,Dobson H,et al.Presence of antigen and antibodies in serum and genital discharges of heifers after intrauterine inoculation of Leptospira interrogans serovar hardjo[J].Research in Veterinary Science,1996,60:157-162.

[7] Butler J E.Bovine immunoglobulins:an augmented review[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1983,43:43-52.

[8] Pierce A E.Specific antibodies at mucous surfaces[J].Vet.Rec.Annot，1999(5):17-36.

[9] Kowald A and Kirkwood T B L.Mitochondrial mutations,cellular instability and aging:modeling the population dynamics of mitochondria[J].Mutat Res,1993,295:93-103.

[10] Williams E J,Fischer D P,Pfeiffer D U.Clinical evaluation of postpartum vaginal mucus reflects uterine bacterial infection and the immune response in cattle[J].Theriogenology,2005,63:102-117.

[11] Butt B,Besser M T E,Senger P L,et al.Specific antibody to Haemophilus Somnus in the bovine uterus following intramuscular immunization[J].Infect Immun,1993,61:2 558-2 562.