【作者】孫立魁，候麗，施燕平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室

在醫(yī)療器械生物學(xué)評價方面，皮膚刺激試驗?zāi)壳叭圆捎眉彝梅ㄟM(jìn)行安全性試驗，而運用減少（Reduction）、替代（Replacement）、優(yōu)化（Refinement）動物試驗的3R原則和采用動物試驗替代方法進(jìn)行安全評價，已成為歐洲社會努力實現(xiàn)的目標(biāo)之一，我國GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價-第2部分：動物保護(hù)要求》目的也是使實驗室動物的數(shù)量和應(yīng)用減少到最低量。皮膚刺激體外替代新方法EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法就是使用體外重組人皮膚表皮模型來代替動物實驗，從而達(dá)到保護(hù)動物的要求。此方法經(jīng)過ECVAM（歐洲替代方法驗證中心）大約10年時間的驗證，證實具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，所以2010年7月最終被OECD TG439采納用來代替家兔Draize法來進(jìn)行皮膚刺激試驗。下面就簡要介紹一下皮膚刺激體外替代新方法及其是如何被ECVAM驗證的。

1 方法

將受試物均勻涂布于體外重組人皮膚表皮模型上，接觸一定時間后用MTT法測試細(xì)胞存活率[1]，若存活率≤50%提示有刺激性。

1.1 表皮模型

法國歐萊雅集團(tuán)經(jīng)過20年研究，從一些乳房整形手術(shù)中獲得表皮角化細(xì)胞(Keratinocytes)，在鋪滿膠原質(zhì)(collagen)培養(yǎng)器中培養(yǎng)兩到三周，具有較強繁殖功能的角化細(xì)胞不斷分化、成層，最終成長為類似于人類表皮的皮膚組織（見圖1、圖2）。

圖1 正常人皮膚表皮結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of normal epidermis

圖2 體外重組人皮膚表皮結(jié)構(gòu)Fig.2 Vitro restructure of normal epidermis

它具有原始皮膚細(xì)胞典型的器官結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，可以像真實皮膚一樣不斷生長，有皮膚屏障功能，在陽光下暴露一定的時間會變黑，能表現(xiàn)一些人逐漸變老的特征，甚至還可以表現(xiàn)人憤怒時的跡象，非常適合用于皮膚刺激體外替代試驗，已經(jīng)商品化的有EpiSkinTM、EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE等。EpiskinTM標(biāo)準(zhǔn)試劑盒每盒包含有12個表皮亞單位。

1.2 方法

(1) 將液體受試物（10±1）μL直接滴在表皮表面，固體受試物（10±2）mg，用小匙小心平鋪于表皮表面，在37oC5%CO2孵箱中孵育15 min之后，每塊表皮至少用10 mLPBS清洗一次，然后再孵育18 h，讓受試物與組織充分作用[2]。

(2) 將表皮與MTT溶液在37oC5%CO2孵箱中孵育3 h，避光放置，分離表皮和膠原基質(zhì)，在室溫中置于酸性異丙醇（0.04mol/L, 840 μL）18h。

(3) 將萃取物(200μL)轉(zhuǎn)移到96孔板，在570 nm測OD值，酸性異丙醇為空白對照。對照表皮的OD值必須界于0.6-0.9，并且5%SDS處理的陽性對照表皮的細(xì)胞活性在0-20%之間。

(4) 每個受試物需要作用于三個表皮，并用三個批號的皮膚模型產(chǎn)品。如果細(xì)胞的存活率≤50%，則受試物具有刺激性。

2 ECVAM對優(yōu)化的試驗方法的驗證

三個實驗室各自用三種方法分別測試58種編碼的化學(xué)物，通過對實驗室內(nèi)、實驗室間測試方法的可重復(fù)性和可預(yù)見性評估，最終研究表明， EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT 、SkinEthicTMRHE可以代替Draize皮膚刺激試驗：R38，被EUTMB.46 & OECD TG 439采納[3]。

表1 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE實驗室內(nèi)、間重復(fù)性比較Tab.1 Comparison of EpiSkinTM, improved EpiDermTMSIT and SkinEthicTM RHE

表2 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE比較Tab.2 Comparison of EpiSkinTM, improved EpiDermTMSIT and SkinEthicTM RHE

3 討論

(1) 傳統(tǒng)Draize法皮膚刺激試驗需要使用家兔對受試物進(jìn)行試驗，使用動物數(shù)量多，具有刺激性的受試物給動物帶來極大的痛苦，而GB/T16886-2《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第2部分：動物保護(hù)要求》明確表明動物保護(hù)的最終目的是廢除動物試驗，減少生物學(xué)試驗中動物用量，完善試驗方法以減輕或消除動物的疼痛，以及用其他方法替代動物試驗[4]。所以從醫(yī)療器械生物學(xué)評價動物保護(hù)角度考慮應(yīng)該采用新方法替代動物實驗。

(2)EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法經(jīng)過權(quán)威組織ECVAM驗證，證實具有較高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，實驗室內(nèi)、實驗室間重復(fù)性和可預(yù)見性好，所以被OECD正式采納用來代替家兔Draize法來進(jìn)行皮膚刺激試驗。

(3) 我國醫(yī)療器械生物學(xué)評價體外替代方法研究起步較晚，發(fā)展較慢，但應(yīng)盡快與國際接軌，采用更多的體外替代試驗方法來取代傳統(tǒng)的動物試驗，且在GB/T16886-1《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第1部分：評價與試驗》也提到只要科學(xué)上證明能獲得與動物試驗同樣的信息，建議優(yōu)先采用體外模式，希望此方法盡快被GB/T16886-10《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗》引用，掀起新一輪動物試驗替代高潮，為醫(yī)療器械生物學(xué)評價替代方法領(lǐng)域提供了更加廣闊的空間。

[1]C.Faller, Predictive ability of reconstructed human epidermis equivalents for the assessment of skin irritation of cosmetics[J],Toxicology in Vitro, 2002, 16,（5）557-572.

[2]彭雙清, 郝衛(wèi)東, 伍一軍.毒理學(xué)替代法[M], 北京, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2009

[4]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第2部分: 動物保護(hù)要求》[S].GB/T16886.2-2000 idt ISO10993-2:1992