韓丹萍 李春剛，2 張耀偉*

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2黑龍江省紅旗農(nóng)場(chǎng)，黑龍江哈爾濱 150088）

大白菜〔Brassic campestrisL. ssp.pekinensis（Lour.）Olsson〕屬于二年生蔬菜作物，需要經(jīng)歷一個(gè)低溫階段才能順利完成發(fā)育轉(zhuǎn)變；萌動(dòng)的種子或幼苗感受低溫通過春化后，在一定的日照條件下即可由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)到生殖生長(zhǎng)，進(jìn)而抽薹開花。國(guó)內(nèi)學(xué)者從春化溫度、光周期反應(yīng)、春化和抽薹生理機(jī)制、耐先期抽薹鑒定與遺傳方面對(duì)大白菜春化與抽薹特性進(jìn)行了廣泛研究（奧巖松和李式軍，1997；劉春香 等，2001；余陽俊 等，2004；趙香梅 等，2005；夏廣清 等，2006；張魯剛 等，2007）。

大白菜通過春化至抽薹，葉片顏色由綠轉(zhuǎn)灰，之后顯蕾，進(jìn)而抽薹開花，這個(gè)過程在弱冬性品種上表現(xiàn)尤為突出。有關(guān)作物春化到抽薹開花期間發(fā)生的葉色轉(zhuǎn)變現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過探討不同冬性的大白菜品種抽薹過程中不同時(shí)期的蛋白質(zhì)、激素、色素含量的差異，從各種激素、色素含量變化和蛋白質(zhì)組分變化方面探討大白菜抽薹過程中發(fā)生葉色轉(zhuǎn)變的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大白菜課題組選育的 4個(gè)不同冬性大白菜高代自交系：弱冬性的A151、A8-1-1和強(qiáng)冬性的C13-1、C30。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 春化處理 試驗(yàn)于2009～2010年春季在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施中心和黑龍江省教育廳寒地蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。4個(gè)大白菜自交系種子播于8 cm×8 cm營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)；子葉展平后放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行春化處理，溫度為8 ℃/3 ℃（晝/夜，下同）、光照16 h/8 h；低溫春化25 d后，于5月20日定植露地，使其在適溫長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)。在實(shí)體解剖鏡下觀察其花芽分化情況，在解剖鏡下生長(zhǎng)點(diǎn)可見數(shù)個(gè)透明無莖花芽突起即為花芽分化期，當(dāng)花芽突起伸長(zhǎng)出現(xiàn)花莖時(shí)即為花莖分化期，新葉顏色由綠轉(zhuǎn)灰時(shí)即為葉色轉(zhuǎn)變期，肉眼可見花蕾時(shí)為花莖伸長(zhǎng)期。

分別在低溫春化處理前和處理后、花芽分化期、花莖分化期、葉色轉(zhuǎn)變期、花莖伸長(zhǎng)期取樣，取植株生長(zhǎng)點(diǎn)部位新生幼嫩葉片測(cè)定葉片中色素、激素含量，并進(jìn)行可溶性蛋白電泳分析。

1.2.2 色素含量測(cè)定 色素提取采用丙酮法，以80%丙酮為空白，在波長(zhǎng)663、645、470 nm處測(cè)定光吸收值。3次重復(fù)。

1.2.3 激素含量測(cè)定 取0.5 g鮮樣，3次重復(fù)，用液氮冷凍后置于-80 ℃保存。內(nèi)源激素（IAA、ABA、GA3）采用高效液相色譜法（美國(guó)Waters HPLC系統(tǒng)）（羅正榮 等，1990）測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Sperisorb C18，ID 4 nm×250 mm，5 μm；預(yù)柱為C18，ID 4 nm×30 mm，柱溫為40 ℃，0.8 mL·min-1恒流洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為207 nm。流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶60%乙酸=5V∶50V∶45V。

1.2.4 可溶性蛋白分析 可溶性蛋白提取采用尚禮邰等（1993）的方法，SDS-PAGE采用陳鈞輝等（2003）的方法。電泳后，把膠放入脫色液微波加熱30 s，在脫色搖床上搖5 min至條帶很淡，然后換染色液微波加熱30 s，搖至條帶清晰，然后用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 色素和激素含量采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（唐啟義，2010）進(jìn)行方差分析,用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜抽薹過程中色素含量的變化

2.1.1 大白菜抽薹過程中3種色素含量變化分析 從圖1、2可以看出，強(qiáng)冬性品系C13-1和C30的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量在花芽分化期均處于較低水平，而后迅速增加，在花莖分化期達(dá)到最高，隨后下降，至葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到低值，隨后升高；弱冬性品系A(chǔ)151和A8-1-1的 3種色素含量均在花莖分化期降到最低，在花莖伸長(zhǎng)期達(dá)到最高。即強(qiáng)冬性品系色素含量最高值出現(xiàn)的時(shí)期恰是弱冬性品系色素含量最低值出現(xiàn)的時(shí)期；另外，強(qiáng)冬性品系從花莖分化期開始3種色素含量均顯著高于弱冬性品系。

圖1 大白菜抽薹過程葉綠素a、葉綠素b含量變化

2.1.2 大白菜抽薹過程中色素間比值變化分析大白菜抽薹過程中色素之間的比值變化分析結(jié)果表明（圖3）：供試 4個(gè)大白菜自交系中除A8-1-1葉綠素 a/b的值外，其他均在葉色轉(zhuǎn)變期最高，而A8-1-1在葉色轉(zhuǎn)變期葉綠素a/b的值也高于前期，在花莖伸長(zhǎng)期達(dá)到最高。而葉綠素（a+b）/類胡蘿卜素的值變化較為復(fù)雜，總體上是春化后比值比春化前稍微增高，花芽分化期下降，此后比值逐漸增高，在葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到最高，花莖伸長(zhǎng)期稍微下降。

圖2 大白菜抽薹過程胡蘿卜素含量變化

圖3 大白菜抽薹過程葉綠素a/b、葉綠素（a+b）/類胡蘿卜素變化

2.2 大白菜抽薹過程中激素含量變化

由圖4可以看出，不同冬性的大白菜品系抽薹過程中IAA含量均出現(xiàn)兩個(gè)峰值，分別在花芽分化期和葉色轉(zhuǎn)變期，在葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到最高，而且在花芽分化期與葉色轉(zhuǎn)變期隨品系冬性的增強(qiáng)，IAA含量逐漸降低。

不同冬性的大白菜品系 GA3含量變化趨勢(shì)基本一致，在花芽分化期稍有降低，而隨著顯蕾期的臨近GA3含量逐漸上升，在葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到最大值，而且此時(shí)強(qiáng)冬性的品系其GA3含量低，其后伴隨花莖的伸長(zhǎng)GA3含量逐漸下降。

從圖5可以看出，不同冬性的大白菜品系A(chǔ)BA含量變化趨勢(shì)也基本一致，除在花莖分化期稍降低外，隨著發(fā)育進(jìn)程ABA含量越來越高，在花莖伸長(zhǎng)期達(dá)到最大值，同期強(qiáng)冬性品系A(chǔ)BA含量高于弱冬性品系。

圖4 大白菜抽薹過程中IAA、GA 3含量變化

2.3 大白菜抽薹過程中可溶性蛋白分析

由圖6可以看出，不同冬性的大白菜品系抽薹過程中可溶性蛋白表達(dá)水平不同，其中分子量約為51 kD的蛋白質(zhì)表達(dá)量最大，其在不同冬性材料的各個(gè)階段表達(dá)，但在春化前表達(dá)微弱，在春化后表達(dá)量驟然上升，隨著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變其表達(dá)量又有所下降。該蛋白質(zhì)在弱冬性品系中表達(dá)量要比強(qiáng)冬性品系稍高一些。另外分子量約為 18 kD的蛋白質(zhì)在各品系春化前不表達(dá)，春化后微弱表達(dá)，隨著生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，在葉色轉(zhuǎn)變期表達(dá)量達(dá)到最大，隨后在花莖伸長(zhǎng)期只有微弱表達(dá)或者不表達(dá)。

圖5 大白菜抽薹過程中ABA含量變化

圖6 大白菜抽薹過程中可溶性蛋白分析

3 結(jié)論與討論

從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，強(qiáng)冬性的品系從花莖分化時(shí)期開始3種色素含量均顯著高于弱冬性品系，強(qiáng)冬性品系色素含量最高值出現(xiàn)的時(shí)期恰是弱冬性品系色素含量最低的時(shí)期，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抽薹過程中葉綠素a/b的值在葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到一峰值，有理由推斷其與葉色轉(zhuǎn)變存在一定關(guān)系。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同冬性的大白菜品系抽薹過程中IAA含量在花芽分化期和葉色轉(zhuǎn)變期有2個(gè)峰值，與王淑芬等（2003）研究在蘿卜抽薹開花過程中，IAA含量大約在花芽分化期和抽薹前期出現(xiàn) 2個(gè)峰值的結(jié)果相似；而且與夏廣清等（2006）對(duì)不同生態(tài)型的大白菜抽薹時(shí)內(nèi)源激素含量研究結(jié)果比較一致的是發(fā)現(xiàn)冬性越弱的品種IAA含量越高，說明IAA的增加有利于大白菜花芽分化，能夠促進(jìn)大白菜由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也促進(jìn)抽薹。

Pharis和King（1985）研究發(fā)現(xiàn)赤霉素在低溫春化抽薹開花過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大白菜抽薹過程中 GA3含量在花芽分化期相對(duì)較低，而隨著顯蕾期的臨近含量逐漸上升，在葉色轉(zhuǎn)變期達(dá)到最大值，而且冬性越強(qiáng)的品系赤霉素含量越低，說明大白菜抽薹前夕GA3有一臨界濃度，達(dá)到這一臨界濃度則促進(jìn)大白菜抽薹開花。

關(guān)于ABA是否參與或影響花芽分化及抽薹開花的認(rèn)識(shí)不一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABA含量在大白菜抽薹過程中葉色轉(zhuǎn)變后、花莖伸長(zhǎng)期達(dá)到峰值，并且冬性越強(qiáng)的品系A(chǔ)BA的含量越高，說明較高濃度的ABA可能促進(jìn)大白菜抽薹開花。

對(duì)應(yīng)植株任何一種形態(tài)上的變化，實(shí)際上都是由于植株體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化所引起的，大白菜發(fā)育過程中形態(tài)發(fā)生變化源于植株體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生變化。本試驗(yàn)中蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果表明，一種分子量約為18 kD的蛋白質(zhì)在葉色轉(zhuǎn)變期表達(dá)量最大，可能與葉色轉(zhuǎn)變、抽薹有關(guān)，但其是否為成花特異蛋白質(zhì)，還需進(jìn)一步分離純化并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究。

綜合分析，大白菜抽薹過程中，葉綠素a/b的值、IAA和GA3含量均在葉色轉(zhuǎn)變期出現(xiàn)峰值，葉色轉(zhuǎn)變后開始花莖伸長(zhǎng)，說明葉色轉(zhuǎn)變是大白菜抽薹的一個(gè)生理信號(hào)。

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