魏尊苗 王學(xué)征 高 鵬 欒非時(shí)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

白粉病是一種廣泛發(fā)生的世界性病害，在甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜等葫蘆科作物上均可嚴(yán)重發(fā)生。單絲殼白粉菌Podosphaera xanthii（原用名Sphaerotheca fuliginea）和二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum（原用名Erysiphe cichoracearum）（Cohen et al.，2004）是瓜類白粉病的主要病原菌（Davis et al.，2002），P. xanthii分化為11個(gè)生理小種，分別為小種0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3 和 N4（Vakalounakis et al.，1994）；G. cichoracearum分化為 2個(gè)生理小種（James & Creight，2002），分別為小種0和小種1。白粉病菌的種類多、分布廣、形態(tài)特征復(fù)雜，傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類方法常引起諸多意見分歧。與傳統(tǒng)鑒別寄主鑒定白粉病菌生理小種相比，利用分子生物學(xué)手段鑒定白粉病菌可以克服很多外界因素，使結(jié)果更科學(xué)準(zhǔn)確。

核糖體DNA（rDNA）的編碼區(qū)序列具有保守性而非編碼區(qū)變異豐富，分析真菌核糖體基因是進(jìn)行真菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的有效方法（Bruns et al.，1991）。rDNA基因間隔區(qū)（IGS，intergenic spacer）被認(rèn)為是rDNA中變異最快的區(qū)域（Paule & Lofquist，1996），是檢測(cè)真菌種群或個(gè)體間遺傳關(guān)系的有效變異序列，是真菌屬內(nèi)種間比較和種內(nèi)變種遺傳多樣性分析的重要分子標(biāo)記（Sugita et al.，2001）。近年來已逐漸用于微生物種水平以下的鑒定、分類，Sugita等（2003）利用IGS測(cè)序鑒定菌株并研究其親緣關(guān)系；張金霞等（2004）、黃晨陽等（2005）利用IGS-RFLP對(duì)側(cè)耳菌株進(jìn)行鑒別；Bunyard等（1996）研究了栽培種雙孢蘑菇、香菇和平菇的IGS，結(jié)果表明各個(gè)栽培種內(nèi)不同菌株的IGS有豐富的多態(tài)性。應(yīng)用 IGS-RFLP對(duì)瓜類白粉病菌菌株進(jìn)行遺傳學(xué)分析和菌株鑒定尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)?zāi)康脑谟趹?yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)黑龍江省瓜類白粉病菌進(jìn)行遺傳多樣性研究，在DNA水平上分析白粉病菌菌株的基因遺傳學(xué)差異，以期對(duì)白粉病菌的鑒定提供穩(wěn)定快速有效的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于葫蘆科作物白粉病盛發(fā)期（2010年7月中下旬）在黑龍江省的哈爾濱、綏化、齊齊哈爾、牡丹江、大慶、雙鴨山、鶴崗、黑河、加格達(dá)奇 9個(gè)主要生態(tài)區(qū)不同設(shè)施不同寄主上采集新鮮感病嚴(yán)重的瓜類白粉病病葉。將采集菌株隔離保存，接種到感病植株上進(jìn)行純化，收集純化白粉病菌于1.5 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱中保存，以備提取 DNA，進(jìn)行 IGS分析。供試菌株的生理小種類型由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室鑒定（待發(fā)表）。分離純化有代表性的16份菌株見表1。

1.2 白粉病菌菌株DNA的提取與檢測(cè)

采用CTAB法（羅瓊，2002）提取白粉病菌菌株DNA，研磨前在裝有白粉病菌的EP管中放少許滅過菌的石英砂，有利于研磨。用1%瓊脂糖檢測(cè)DNA質(zhì)量，將提取質(zhì)量合格的DNA置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 白粉病菌菌株的IGS-PCR擴(kuò)增與酶切

擴(kuò)增體系：dNTP（2.5 mmol·Leach-1）2 μL，Primer各 1 μL（表2），ExTaqTMDNA polymerase 1 U，10×PCR buffer（mg2+）2.5 μL，DNA 模板 1 μL，用 ddH2O補(bǔ)齊至 25 μL。

表1 供試白粉病菌菌株

IGS-PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃變性12 min，60 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)齊7 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，置于凝膠成像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

本試驗(yàn)采用 3種快速限制性內(nèi)切酶，即MspⅠ、AsuⅠ、Hinp1Ⅰ（由 Fermentas公司提供）。15 μL 酶切反應(yīng)體系：2 μL PCR 產(chǎn)物，1 μL 10×buffer，0.2 μL內(nèi)切酶，6.8 μL無菌去離子水。反應(yīng)體系：37 ℃，10 min。

表2 IGS1、IGS2擴(kuò)增反應(yīng)的引物

1.4 電泳檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

以100 bp DNA ladder Mark er（TransGen Biotech）為分子量對(duì)照，取5 μL PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)EB染色后，拍照記錄圖譜。電泳圖譜中的每一條帶均作為1個(gè)位點(diǎn)，按Nei和Li（1979）提出的方法記錄酶切圖譜上同一分子量處條帶的有無，有條帶者記為“1”，無則為“0”，制成0-1矩陣表用于數(shù)據(jù)處理。利用NTSYS-PC軟件采用平均連鎖法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，自動(dòng)生成遺傳相似系數(shù)矩陣和樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取各菌株的總DNA，成功提取了16份白粉病菌的DNA，用1%含有EB的瓊脂糖凝膠對(duì)16個(gè)菌株DNA樣品進(jìn)行電泳，結(jié)果所檢測(cè)樣本的DNA均無降解，無雜質(zhì)，適合IGS擴(kuò)增，如圖1所示。

圖1 16個(gè)白粉病菌菌株DNA

2.2 IGS-RFLP分析

IGS1擴(kuò)增結(jié)果表明，兩對(duì) IGS1引物擴(kuò)增結(jié)果相似，供試菌株間 IGS1片段大小和數(shù)量存在豐富的多態(tài)性，不同菌株間 IGS1片段的數(shù)量存在顯著差異，除菌株md和菌株qq擴(kuò)增出一條帶外，其他菌株均為多條，片段長(zhǎng)度在500～2 000 bp之間，供試菌株中有12株擴(kuò)增出了IGS1片段（圖2）。

IGS2擴(kuò)增結(jié)果表明，供試菌株間IGS2亦存在較大差異但多態(tài)性較IGS1低，擴(kuò)增條帶數(shù)在1～4條之間，片段大小多在2 000 bp左右，較IGS1長(zhǎng)。IGS1與IGS2均未發(fā)現(xiàn)小種間特異片段，供試菌株中只有8株擴(kuò)增出了IGS2片段（圖3）。

圖2 供試菌株IGS1擴(kuò)增圖譜

應(yīng)用MspⅠ、AsuⅠ、Hinp1Ⅰ3個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)供試菌株的IGS1和IGS2片段進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示每個(gè)菌株的IGS1和IGS2均存在3個(gè)內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，不同菌株電泳后產(chǎn)生不同的帶型圖譜，呈現(xiàn)豐富的多態(tài)性，成為樣本特有的DNA指紋，但并未發(fā)現(xiàn)小種間特異片段。以IGS1MspⅠ酶切圖譜為例，如圖4所示。

圖3 部分供試菌株IGS2擴(kuò)增圖譜

圖4 供試菌株IGS1 MspⅠ酶切圖譜

2.3 IGS1-RFLP聚類分析

用NTSYS-PC軟件對(duì)其中酶切效果好的10個(gè)菌株IGS1-RFLP圖譜進(jìn)行分析，計(jì)算菌株的遺傳相似系數(shù)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，菌株遺傳相似系數(shù)在0.460 0～0.800 0之間（表3），說明黑龍江省瓜類白粉病菌存在較豐富的遺傳多樣性，其中來自哈爾濱的菌株 hr-1與菌株 hr-2遺傳相似系數(shù)最大，為0.80；來自鶴崗的菌株 hg與來自哈爾濱的菌株hr-3遺傳相似系數(shù)最小，為0.460 0。以遺傳相似系數(shù)0.60為閾值，可將供試菌株分為3類（圖5）。

同為生理小種N1的菌株hg與菌株md遺傳相似系數(shù)比較小，為0.52，分別被聚到了第Ⅲ類和第Ⅰ類，其他均為生理小種1的菌株被分別聚到了第Ⅰ類、第Ⅱ類和第Ⅲ類，相同菌株并未完全聚為一類，因生理小種的劃分基于白粉病菌對(duì)鑒別寄主的致病性，由此可知白粉病菌群體基因型與致病性之間有一定相關(guān)性但不呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。

從寄主上看，第Ⅰ類包括甜瓜、黃瓜和西瓜，第Ⅱ類包括南瓜和甜瓜，第Ⅲ類只包含一個(gè)菌株，其寄主為黃瓜，初步確定供試白粉病菌群體基因型的劃分與寄主來源不直接相關(guān)；從地域上看，來自鶴崗的hg菌株單獨(dú)聚為第Ⅲ類；來自哈爾濱的菌株hr-4、佳木斯的菌株jm和齊齊哈爾的菌株qq聚為第Ⅱ類；其他菌株聚到第Ⅰ類。相同或相近地區(qū)的白粉病菌并未完全聚到一起，可知白粉病菌群體基因型的劃分與菌株地理來源無直接關(guān)系。從設(shè)施上看第Ⅰ類包括大棚和溫室，第Ⅱ類包括露地和溫室，第Ⅲ類只包含一個(gè)菌株，其設(shè)施為大棚，可見白粉病菌群體基因型的劃分與菌株來源設(shè)施類型之間無直接關(guān)系。

圖5 10個(gè)白粉病菌基于IGS-RFLP分子標(biāo)記

表3 10個(gè)供試菌株的遺傳相似系數(shù)矩陣

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)應(yīng)用 IGS-RFLP分析對(duì)黑龍江省瓜類白粉病菌進(jìn)行遺傳多樣性研究和菌株鑒別，應(yīng)用真菌IGS通用引物對(duì)黑龍江省瓜類白粉病菌進(jìn)行擴(kuò)增，菌株間表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，IGS1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度較IGS2擴(kuò)增片段小，但是多態(tài)性較IGS2高，采用3種快速限制性內(nèi)切酶對(duì)白粉菌的IGS1和IGS2擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示均具良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，酶切圖譜具豐富的多態(tài)性，菌株間有顯著差異，IGS-RFLP可以將供試菌株有效地進(jìn)行鑒別，但未發(fā)現(xiàn)小種間的特異片段，還有待進(jìn)一步的研究。通過對(duì)IGS1-RFLP酶切圖譜聚類分析，可知菌株間的相似系數(shù)在0.460 0～0.800 0之間，說明黑龍江省瓜類白粉病菌具有豐富的遺傳多樣性，與IGS擴(kuò)增結(jié)果一致；本試驗(yàn)初步確定葫蘆科白粉病菌致病性與DNA多態(tài)性不形成一一對(duì)應(yīng)關(guān)系；菌株的遺傳多樣性與菌株地理來源、寄主來源及設(shè)施類型未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。此類結(jié)果的研究報(bào)道很多，段會(huì)軍等（2007）對(duì)河北省西瓜枯萎病生理小種鑒定并進(jìn)行AFLP分析，結(jié)果顯示AFLP類群劃分與致病性鑒定劃分的生理小種之間存在一定相關(guān)性，但與菌株的地理來源無關(guān)；del Pino等（2002）認(rèn)為西班牙葫蘆科白粉病菌小種與致病性間沒有明顯相關(guān)性；Valerio等（2005）用RAPD和RFLP兩種方法分析大麥炭疽病菌，發(fā)現(xiàn)致病性與分子標(biāo)記之間沒有相關(guān)性。

IGS中含有許多重復(fù)序列或亞重復(fù)序列，在有絲分裂時(shí)經(jīng)常發(fā)生不均等交換，單位重復(fù)數(shù)目的變化造成IGS長(zhǎng)度的變異（Martin et al.，1999），這種變異在電泳中表現(xiàn)為遷移率的不同，呈現(xiàn)多個(gè)條帶。不同菌株的重復(fù)序列或亞重復(fù)序列的數(shù)量不同，造成了其長(zhǎng)度異質(zhì)性（Albee et al.，2006）。RFLP的產(chǎn)生是由于點(diǎn)突變，DNA的重排、插入或缺失引起的，利用RFLP進(jìn)行分類鑒定時(shí)的一個(gè)重要問題就是根據(jù)不同的分類水平（屬、種、株）研究選擇不同的 DNA片段（Goodwin et al.，1992）。真菌的遺傳學(xué)研究表明，幾乎所有的擔(dān)子菌IGS2比IGS1區(qū)長(zhǎng)，變異性大，進(jìn)化較快，可用于種間和種內(nèi)遺傳多樣性研究，但本試驗(yàn)所測(cè)黑龍江省葫蘆科瓜類白粉病菌的IGS區(qū)序列卻不完全相同，IGS2區(qū)長(zhǎng)于IGS1區(qū)，但I(xiàn)GS1區(qū)多態(tài)性更強(qiáng)，這和梁宏等（2006）的研究結(jié)果相同。

在對(duì)不同菌株的 IGS區(qū)的擴(kuò)增過程中，大部分菌株均可得到成功擴(kuò)增，但是也有部分菌株IGS2擴(kuò)增不出來，雖然在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了一系列的調(diào)整，但是這些菌株仍擴(kuò)增不出來，這與代玉梅等（2004）、岳海梅等（2010）對(duì)IGS區(qū)的研究結(jié)果一致，說明目前使用的PCR通用引物還不夠保守，未必適合所有菌株，如果能有針對(duì)性的設(shè)計(jì)引物應(yīng)該可以有更好的效果。取樣過程中每一個(gè)菌樣盡量多收集菌株以保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，本試驗(yàn)只對(duì)黑龍江省瓜類白粉病菌進(jìn)行了研究，如能擴(kuò)大取樣范圍則更具有代表性且有說服力。

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