樊梓鸞，王振宇，2＊，左麗麗，田雙起

（1.哈爾濱工業(yè)大學 食品科學與工程學院，哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040）

大量數(shù)據(jù)表明，許多慢性病都與過量的自由基產(chǎn)生有關(guān)。自由基通常包括活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）。大多數(shù)活性氧產(chǎn)生于細胞的線粒體呼吸鏈［1］。內(nèi)源性代謝反應(yīng)過程中，好氧細胞產(chǎn)生活性氧，如超氧陰離子，過氧化氫（雙氧水），羥自由基（OH·），在缺氧條件下，線粒體呼吸鏈產(chǎn)生一氧化氮（NO），它可以產(chǎn)生活性氮。RNS可以進一步反應(yīng)生成其他反應(yīng)基團，例如，丙二醛和4－羥基物，將誘導過多的脂質(zhì)過氧化。

紅豆越橘（Vaccinium vitis－idaea）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）常綠小灌木［2］，俗稱雅格達，主要分布N52°以北大興安嶺森林中，果實為亮紅色，是提取天然色素的重要原料，在越橘的果實和莖葉中含有花色苷、黃酮、萜類等多種活性成分。紅豆越橘中最主要的酚類化合物是花色苷，是一種強抗氧化劑，能夠抑制脂質(zhì)過氧化和生物系統(tǒng)的氧化；可以預(yù)防和減少炎癥、癌細胞增殖的危險［3］。飲食富含花色苷的果汁對冠狀心臟病人有益，體外和動物實驗表明，花色苷可以有效的改善記憶力［4］。本文采用X－5大孔樹脂純化富集花色苷，并對分離得到的組分進行活性跟蹤，分析抗氧化和抗癌細胞增值活性。為開發(fā)高純度花色苷類物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅豆越桔樣品于2010年采自大興安嶺加格達奇，－20℃凍存。癌細胞株：結(jié)腸癌HT29、卵巢癌Hela、肺癌A549和肝癌HepG－2細胞，由哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤分院提供。

1.2 實驗儀器

BS110型電子天平；721型分光光度計，JJ－2型組織粉碎機，F(xiàn)A25高剪切分散乳化機。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅豆越橘提取物制備。用天平稱取凍存漿果20kg，加入冷凍的80%丙酮（1∶2w／v）在組織搗碎機中勻漿5min，從搗碎機中取出勻漿，在高速均質(zhì)機中均質(zhì)3min，放入抽濾瓶上的布式漏斗中，漏斗上放置濾紙，抽濾瓶接真空泵進行抽濾。收集濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏，于－80℃儲存，用于后續(xù)純化富集用。

1.3.2 大孔樹脂富集純化紅豆越橘花色苷

通過預(yù)實驗選定大孔吸附樹脂X－5富集純化花色苷，首先進行樹脂預(yù)處理，裝柱上樣，靜態(tài)吸附，用蒸餾水沖洗柱層析，除去糖分及小分子物質(zhì)，用斐林試劑（斐林試 劑 甲：0.1g／mL NaOH，斐 林 試 劑 乙：0.05g／mL CuSO4）檢測殘?zhí)橇?，大約兩個柱體積后既無殘?zhí)?。采?0%～60%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2mL／min，每250mL收集一餾分，分別測定多酚含量和抗氧化活性。

1.3.3 樣品中多酚含量測定

采用菲林酚比色法檢測多酚含量［5］。精密吸取125μL沒食子酸標準溶液或漿果提取物，分別置于l0mL試管中，加入0.5mL的蒸餾水，再加入125μL的菲林酚試劑（FCR），樣品混合充分，靜置6min，加入1.25mL 7%Na2CO3水溶液。用水補足終體積到3mL。90min后在760nm測定藍色溶液的吸光度。沒食子酸作標品，結(jié)果用平均值表示［mg沒食子酸等同量／l00g鮮重（fresh weight FW）］，±SD三個重復。

1.3.4 ABTS法測定抗氧化能力

配制ABTS自由基工作液。將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL不同濃度的稀釋提取液加入1.5mL ABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在734nm處測定吸光度［6］。每份樣品平行操作3次，計算公式為：

清除率（%）＝［（AContral－ASample）／AContral］×100%

式中：AContral為1.5mL ABTS溶液與0.1mL甲醇混合后的吸光度，ASample為1.5mL ABTS溶液與0.1mL樣品混合后的吸光度。

1.3.5 抗細胞增值活性

所有細胞培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，50單位／mL青霉素，50μg／mL鏈霉素，100μg／mL慶大霉素。收集對數(shù)生長期的癌細胞，使其濃度在1×104～5×104細胞／每孔，在96孔板上鋪板，37℃培養(yǎng)12h后，加入不同濃度的提取物，三次重復。無提取物的培養(yǎng)基作為空白，處理48h，72h后，加入 MTT，4h后，棄去上清液，加入150μL DMSO，在490nm下用酶標儀測定細胞的增殖活性［7］。

1.4 統(tǒng)計分析

用Sigmaplot 10.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂X－5富集有效組分的確定

對紅豆越桔粗提物進行富集，通過預(yù)實驗選取X－5大孔吸附樹脂，采用10%～60%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2mL／min，每250mL收集一組餾分，共收集了12個組分，結(jié)果如圖1所示，組分2、3、4、5具有較高的多酚含量和抗氧化活性，因此將此四種組分分別命名為LB－2、LB－3、LB－4、LB－5，并將其混合組分命名為LB－MIX。

圖1 大孔吸附樹脂X－5富集分離紅豆越橘丙酮提取物，10%～60%乙醇梯度洗脫共收集12個組分

2.2 抗結(jié)腸癌HT29細胞增殖活性

將大孔樹脂純化的后的5組樣品及陽性對照環(huán)磷酰胺，分別作用結(jié)腸癌HT29細胞48h和72h后，如圖2所示，處理48h后，環(huán)磷酰胺和LB－4各劑量組對結(jié)腸癌細胞的抑制活性沒有 LB－MIX、LB－2、LB－3和 LB－5效果明顯。其中LB－MIX在48h后對結(jié)腸癌細胞的抑制活性最強，但作用72h后，LB－5對癌細胞的抑制活性最大，細胞只增殖了22.25±5.45%。

圖2 紅豆越橘初級純化產(chǎn)物在48h和72h抑制結(jié)腸癌HT29細胞增殖活性

2.3 抗肝癌HepG2細胞增殖活性

如圖3所示，各組分抑制肝癌細胞HepG2細胞的增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著時間的延長，劑量的增大表現(xiàn)出明顯的抑制肝癌細胞活性。48h，LB－MIX對癌細胞的抑制增殖活性達到22.25±5.45%。72h，對癌細胞的抑制增殖活性達到13.64±0.88%。其次為 LB－5、LB－3。LB－2、LB－4和環(huán)磷酰胺對癌細胞抑制增殖活性沒有達到半數(shù)抑制率。

圖3 紅豆越橘初級純化產(chǎn)物在48h和72h抑制肝癌HepG2細胞增殖活性

2.4 抗卵巢癌Hela細胞增殖活性

如圖4所示，LB－MIX、LB－5、LB－3能夠明顯的抑制卵巢癌Hela細胞的增殖并隨著濃度的增加抑制活性增強，48h，72h后，LB－MIX濃度達到400μg／mL時，其對癌細胞的抑制增殖活性分別達到29.04±3.32%和24.27±3.05%。其次，為LB－5和LB－3。

圖4 紅豆越橘初級純化產(chǎn)物在48h和72h抑制卵巢癌Hela細胞增殖活性

2.5 抗肺癌A549細胞增殖活性

圖5 紅豆越橘初級純化產(chǎn)物在48h和72h抑制肺癌A549細胞增殖活性

如圖5所示，抗癌活性由大到小依次為LB－MIX＞ LB－5＞LB－3＞ LB－2＞ LB－4＞ 環(huán)磷酰胺。72h后，LB－MIX抑制A549增殖最有效，其只增殖了12.67±0.37%。

3 結(jié)論

紅豆越橘粗提物經(jīng)過大孔樹脂X－5純化后，分部收集最有效地組分，進行抗氧化和抗癌細胞增殖活性分析，結(jié)果顯示，紅豆越橘的總純化組分的抗癌活性比分部收集的組分還要好，因此選定總純化組分作為后續(xù)的研究對象。

［1］Kouakou－Siransy，G.，Sahpaz，S.，Irie－Nguessan，G.，et al.Oxygen species scavenger activities and phenolic contents of four West African plants［J］.Food Chem，2010，118（2）：430－435.

［2］關(guān)麗華，王秀華.紅豆越橘中化學成分的研究進展.北方園藝，2007（4）：81－83.

［3］Konic－Ristic，A.，Savikin，K.，Zdunic，G.，Jankovic，T.，Juranic，Z.，Menkovic，N.＆Stankovic，I.Biological activity and chemical composition of different berry juices.Food Chemistry.2011，125（4）：1412－1417.

［4］Lehtonen，H.M.，Rantala，M.，Suomela，J.P.，Viitanen，M.＆Kallio，H.Urinary Excretion of the Main Anthocyanin in Lingonberry （Vaccinium vitis－idaea），Cyanidin 3－O－Galactoside，and Its Metabolites.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（10）：4447－4451.

［5］Wang，M.，Liu，J.R.，Gao，J.M.，et al.Antioxidant Activity of Tartary Buckwheat Bran Extract and Its Effect on the Lipid Profile of Hyperlipidemic Rats［J］.J Agr Food Chem，2009，57（11）：5106－5112.

［6］Bao，J.S.，Cai，Y.Z.，Sun，M.，et al.Anthocyanins，flavonols，and free radical scavenging activity of Chinese bayberry （Myrica rubra）extracts and their color properties and stability.J Agr Food Chem，2005，53（6）：2327－2332.

［7］Prasad，K.N.，Xie，H.H.，Hao，J.，Yang，B.，Qiu，S.X.，Wei，X.Y.，Chen，F(xiàn).，＆Jiang，Y.M.（2010）.Antioxidant and anticancer activities of 8－h(huán)ydroxypsoralen isolated from wampee Clausena lansium （Lour.）Skeels peel.Food Chemistry，118（1）：62－66.