高文慧，范彩霞，陳志良(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣州市510515；.廣東省粵北人民醫(yī)院藥學(xué)部，韶關(guān)市5106)

超順磁氧化鐵納米粒(Superparamagnetic oxide iron nanoparticles，SPIO-NPs)是一種新型的磁共振造影劑，由于其所特有的小粒子、超順磁性和低毒性等特點(diǎn)，在磁靶向給藥和熱療等方面也具有突出的優(yōu)勢。當(dāng)SPIO-NPs的粒徑小于100 nm時(shí)，能逃避肝、脾的吞噬，達(dá)到全身分布，此時(shí)的納米粒能進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，被淋巴結(jié)內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬；如果發(fā)生腫瘤部位的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，吞噬了SPIO-NPs的淋巴結(jié)正常組織的T2信號值將下降，而腫瘤組織的T2信號值不變，從而準(zhǔn)確判斷腫瘤是否轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移腫瘤的位置和大小。在以上SPIO-NPs的包被材料上嫁接腫瘤細(xì)胞表面某些特異性受體的配體后，SPIO-NPs就能特異性結(jié)合腫瘤組織，使其T2信號值下降，與周圍正常組織分清界限，確定腫瘤邊緣及大小[1]。本課題組(腫瘤靶向新型磁共振造影劑的研制與體內(nèi)、外評價(jià)課題組)現(xiàn)已合成了超小粒徑的SPIO-NPs，并包被以羧甲基殼聚糖，以提高其溶液的穩(wěn)定性和親水性，再在羧甲基殼聚糖上嫁接以葉酸，由于大部分腫瘤表面具有葉酸受體，嫁接了葉酸的SPIO-NPs在體內(nèi)能靶向結(jié)合有葉酸受體的腫瘤組織，從而達(dá)到靶向造影腫瘤組織的目的[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在評價(jià)葉酸-羧甲基殼聚糖-SPIO-NPs(Folic acid-O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，F(xiàn)A-OCMCS-SPIO-NPs)和羧甲基殼聚糖-SPIO-NPs(O-carboxymethyl chitosans superparamagnetic oxide iron nanoparticles，OCMCS-SPIO-NPs)的急性毒性，以及以葡聚糖-SPIO-NPs(dextran-superparamagnetic oxide iron nanoparticles，dextran-SPIO-NPs)為不能逃避肝、脾吞噬的陽性對照，評價(jià)2種造影劑的抗吞噬性，為將來動(dòng)物體內(nèi)的更深入研究打好基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HERMLE2360高速低溫離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；超濾離心管(10 kD，德國Sartorius公司)；CLZ型恒溫磁力攪拌器(河南鞏義予華儀器廠)；SK5200HL型超聲粉碎儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Sephacrys-300HR凝膠(美國Pharmacia公司)；透析袋(截留相對分子量8000～15000，上海源聚生物科技有限公司)。

1.2 試藥

FA-OCMCS-SPIO-NPs、OCMCS-SPIO-NPs和dextran-SPIO-NPs均由南方醫(yī)院藥學(xué)部科研組自制，含量以鐵濃度表示，分別為18.46、18.67、20.32 mg(Fe)·mL－1，經(jīng)測定，3種納米粒的強(qiáng)均粒徑分別為41.4、38.2、125 nm。

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、氨水、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、甲醛和亞鐵氰化鉀(廣州化學(xué)試劑有限公司)；0.5%伊紅溶液(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；葡聚糖(分子量40000)、碳二亞胺(美國Sigma公司)；羧甲基殼聚糖(分子量10000～20000，脫乙?；取?3%，羧基取代度≥87%，青島海普生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級KM小鼠，體重(20±2)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號:SCXK(粵)2006-0015。

2 方法

2.1 3種納米粒的制備

2.1.1 OCMCS-SPIO-NPs的制備。取摩爾比2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，將二者溶解并混合，充氮攪拌下加適量氨水至pH約為11，升溫反應(yīng)1 h后磁性分離，并水洗4次，加入30 g·L－1碳二亞胺的磷酸鹽緩沖溶液，超聲分散，轉(zhuǎn)入3%的羧甲基殼聚糖溶液中，超聲反應(yīng)1 h，產(chǎn)物離心30 min，取上清液過葡聚糖凝膠柱，收集首峰，蒸餾水透析24 h，超濾濃縮備用[3]。

2.1.2 FA-OCMCS-SPIO-NPs的制備。取蒸餾水透析過的OCMCS-SPIO-NPs，加一半體積的無水乙醇，高速離心，沉淀用無水乙醇、二甲亞砜各洗3遍，無水二甲亞砜超聲分散備用。參考文獻(xiàn)[4]方法合成葉酸活性酯，充氮加熱下，將葉酸活性酯加入OCMCS-SPIO-NPs的無水二甲亞砜溶液中，反應(yīng)4 h，產(chǎn)物蒸餾水透析24 h，超濾濃縮備用[2]。

2.1.3 dextran-SPIO-NPs的制備。將葡聚糖與摩爾比為2∶1的FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O充分混合，充氮攪拌下以堿性共沉淀法制備[5]。

2.2 急性毒性評價(jià)

取小鼠70只，分為空白組、FA-OCMCS-SPIO-NPs組和OCMCS-SPIO-NPs組，空白組10只，其它2組每組30只，♂♀各半。將2個(gè)給藥組內(nèi)的小鼠再平均分成高、中、低3個(gè)劑量組，每組10只，♂♀各半。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，尾靜脈給予昆明小鼠266.75 mg(Fe)·kg－1的SPIO-NPs后，出現(xiàn)短時(shí)少動(dòng)現(xiàn)象，而最大給藥劑量(438.5 mg(Fe)·kg－1)下，小鼠仍未出現(xiàn)死亡。本實(shí)驗(yàn)中SPIO-NPs經(jīng)包被后理論上毒性會(huì)下降，故以278 mg(Fe)·kg－1為最低給藥濃度，以1∶0.8為組間距設(shè)計(jì)3個(gè)濃度梯度組(即278、347.5、434.5 mg(Fe)·kg－1)，尾靜脈一次性給藥后，觀察14 d內(nèi)小鼠的死亡、飲食和體重變化情況?？瞻捉M尾靜脈注射0.5 mL生理鹽水，14 d后處死，觀察心、肝、脾、肺、腎并拍照。2個(gè)給藥組存活小鼠14 d后處死，從高、中、低3個(gè)劑量組中各取幾只小鼠解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎并拍照。

2.3 抗吞噬性評價(jià)

在1.68～2.52 mg(Fe)·kg－1的給藥劑量下，超小SPIO-NPs(粒徑小于100 nm)在人體內(nèi)的t1/2(24～36 h)遠(yuǎn)高于動(dòng)物(2～3 h)，故動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多采用高劑量給藥(11.2～56 mg(Fe)·kg－1)[1]。為了考察小鼠肝、脾對造影劑的吞噬作用，本實(shí)驗(yàn)中選取了較高的給藥劑量(約56 mg(Fe)·kg－1)進(jìn)行考察。

取♂小鼠20只，分成4組，每組5只，分別從尾靜脈注射FA-OCMCS-SPIO-NPs(54.4mg(Fe)·kg－1)、OCMCS-SPIONPs(56.2 mg(Fe)·kg－1)、dextran-SPIO-NPs(57.6 mg(Fe)·kg－1)和生理鹽水(0.2 mL)。24 h后，全部脫頸椎處死，取肝和脾于4%福爾馬林溶液中固定24 h，石蠟包埋并做普魯士藍(lán)染色切片。以注射生理鹽水的小鼠為陰性對照組，注射dextran-SPIO-NPs的小鼠為陽性對照組，依據(jù)肝、脾吞噬的SPIO納米粒經(jīng)普魯士藍(lán)染色后呈藍(lán)色來評價(jià)2種造影劑抗肝、脾吞噬的能力。如果合成的2種納米粒能逃避肝、脾的吞噬，則其與dextran-SPIO-NPs組相比，表現(xiàn)為染色后的切片上沒有或者只有零星少許藍(lán)色。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性評價(jià)

FA-OCMCS-SPIO-NPs及OCMCS-SPIO-NPs的各給藥劑量組相關(guān)情況如表1和表2所示。

表1 FA-OCMCS-SPIO-NPs各給藥劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1Tests results of FA-OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

表2 OCMCS-SPIO-NPs各給藥劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2Test results of OCMCS-SPIO-NPs groups of different doses

由于FA-OCMCS-SPIO-NPs組和OCMCS-SPIO-NPs組的小鼠均未出現(xiàn)死亡，依據(jù)新藥臨床前研究指導(dǎo)原則[7]，2種納米粒的LD50＞434.5 mg(Fe)·kg－1，所有小鼠均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。14 d后處死小鼠，解剖并觀察各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎，與空白組相比均未發(fā)現(xiàn)明顯的組織損傷，詳見圖1、圖2。

圖1 給予OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各給藥劑量組小鼠各組織照片F(xiàn)ig 1Pictures of each tissue in each group after mice are injected with OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

3.2 抗吞噬性評價(jià)

各組小鼠肝、脾普魯士藍(lán)染色切片照片見圖3、圖4。

圖2 給予FA-OCMCS-SPIO-NPs 14 d后各給藥劑量組小鼠各組織照片F(xiàn)ig 2Pictures of each tissue in each group after mice are injected with FA-OCMCS-SPIO-NPs with different doses for 14 days

圖3、圖4中各組織切片照片上箭頭所指的點(diǎn)是被染成藍(lán)色的SPIO-NPs。從這些切片圖上可以清晰地看到粒徑大于100 nm的dextran-SPIO-NPs(圖3D、圖4D)無法逃避肝、脾中巨噬細(xì)胞的吞噬，而粒徑小于50 nm的FA-OCMCS-SPIO-NPs能完全逃避吞噬，OCMCS-SPIO-NPs則大部分逃避了吞噬。

4 討論

2種新型磁共振造影劑的急性毒性結(jié)果顯示，在最大給藥劑量下，小鼠均無明顯的毒性反應(yīng)，表明其具有良好的安全性。FA-OCMCS-SPIO-NPs高劑量組中，小鼠表現(xiàn)出輕微的食欲減退，可能是由于嫁接葉酸以后納米粒的粒徑有所變大，毒性有所增加，也有可能是殘留溶劑二甲亞砜的影響。本實(shí)驗(yàn)中SPIO-NPs包被以親水性材料羧甲基殼聚糖后，靜脈給藥劑量達(dá)434.5 mg(Fe)·kg－1時(shí)也沒有明顯的毒性反應(yīng)，這可能是因?yàn)榘徊牧虾螅{米粒對體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞性減小，降低了超順磁氧化鐵的毒性。

粒徑小于100 nm的超順磁氧化鐵理論上可以逃避肝、脾的吞噬，達(dá)到全身分布的目的，這樣就可能對全身除肝、脾部位的腫瘤、血管及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行造影，打破了傳統(tǒng)的超順磁氧化鐵只針對肝臟造影的現(xiàn)狀，具有重要的研究意義。通過實(shí)驗(yàn)可知，2種磁共振造影劑均能逃避巨噬細(xì)胞豐富的肝、脾組織的吞噬。雖然肝、脾對OCMCS-SPIO-NPs有輕微的吞噬，但與dextran-SPIO-NPs相比，吞噬量很少，這與筆者之前體外評價(jià)巨噬細(xì)胞對FA-OCMCS-SPIO-NPs和OCMCSSPIO-NPs的吞噬結(jié)果相吻合[2，8]，這為今后考察二者的造影效果奠定了一定的基礎(chǔ)。同時(shí)，二者又可以作為腫瘤靶向治療的藥物載體[9]，故對其研究具有巨大的應(yīng)用前景。

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