李國輝,李磊,張厚才

(1.濟(jì)南市婦幼保健院,山東 濟(jì)南 250001;2.山東省分析測試中心,山東 濟(jì)南 250014;3.月旭材料科技(上海)有限公司,上海 201203)

他克莫司(acrolimus)又名FK506,是從鏈霉菌屬中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,為一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑,主要通過抑制白介素-2(L-2)的釋放,全面抑制T淋巴細(xì)胞的作用,較環(huán)孢素(CsA)強(qiáng)100倍。近年來,作為肝、腎移植的一線用藥,已在日本、美國等14個(gè)國家上市。臨床實(shí)驗(yàn)表明,其在心、肺、腸、骨髓等移植中應(yīng)用有很好的療效。同時(shí)在治療特應(yīng)性皮炎(AD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中發(fā)揮著積極的作用。目前市場有片劑、膠囊劑、注射劑、軟膏劑等,其中軟膏劑適用于因潛在危險(xiǎn)而不宜使用傳統(tǒng)療法、或?qū)鹘y(tǒng)療法反應(yīng)不充分、或無法耐受傳統(tǒng)療法的中到重度特應(yīng)性皮炎患者。在軟膏劑中輔料量多,主藥量微,且主藥理化性質(zhì)較獨(dú)特,含量測定較難。他克莫司軟膏的含量測定目前已有報(bào)道[1],但是前處理不夠徹底,基體干擾較大。本文采用SPE小柱對軟膏基體進(jìn)行凈化,用Diol色譜柱進(jìn)行分離,大大降低了基體的干擾,操作簡單、快捷、專屬性強(qiáng),故該方法可用作他克莫司軟膏劑的主含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:高效液相色譜儀(上海伍豐儀器,LC100二元高壓系統(tǒng),紫外檢測器);色譜柱 Ultimate·XB-Diol(4.6 mm ×250 mm,5 μ m);Welchrom ·硅膠小柱(1 000 g/6L);1/1萬電子天平(上海舜宇恒平);超聲波清洗機(jī)(昆山超聲波儀器廠)。

他克莫司對照品(中檢所),他克莫司軟膏劑(市場購買),乙腈(色譜純,HoneyWell),正己烷(色譜純,HoneyWell),正丁基氯(分析純,國藥集團(tuán)),水(重蒸餾水)。

1.2 色譜條件

色譜柱 Ultimate·XB-Diol(4.6×250 mm,5 μ m);檢測波長225 nm;流動(dòng)相 正己烷-正丁基氯-乙腈 7∶2∶1;溫度室溫;流速1.7 mL/min;進(jìn)樣量 :5 μ L 。

1.3 樣品溶液的制備

供試樣品溶液的制備:取他克莫司軟膏樣品1 g置于有封蓋的離心管中,用5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液溶解、振蕩,使之成為懸濁液,離心(3 000 r/min)5 min,取出上清液,向離心管中再次加入5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液,振蕩,使之成為懸濁液,再次離心,取出上清液。合并兩次上清液,將其通過活化的硅膠小柱后,用5 mL(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液洗滌6次。再用5 mL乙酸乙酯和5 mL乙腈依次洗脫,收集乙腈洗脫液,氮?dú)獯蹈?殘?jiān)尤? mL(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液溶解即得。

硅膠小柱的活化:取1 000 g/6L硅膠小柱,用5 mL乙腈潤洗,再用(正己烷-乙酸乙酯10∶1)混合溶液每次5 mL沖洗兩次,備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液的制備:精密稱取他克莫司對照品適量,用(正己烷-正丁基氯-乙腈 1∶1∶1)混合溶液溶解,配置成濃度為1 g/L的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密量取他克莫司對照品儲備液1 mL,用(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液定容到10 mL,配置成濃度為0.1 g/L的他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液。

陰性樣品溶液:取不含他克莫司的陰性樣品適量,按供試品溶液處理方法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖

取他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品溶液、他克莫司樣品溶液和陰性樣品溶液各20 μ L,按照1.2項(xiàng)條件測試,譜圖如圖1～3。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取他克莫司對照品溶液20 μ L,按照1.2項(xiàng)色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6針,計(jì)算其峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.30%,說明該方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取他克莫司軟膏,按照1.3項(xiàng)方法,同時(shí)制備6份樣品溶液,按照1.2項(xiàng)色譜條件,各取20 μ L進(jìn)樣測定,同時(shí)對照品溶液進(jìn)行檢測,按照外標(biāo)法定量,6份樣品檢測結(jié)果平均含量為0.1007%,計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.93%,說明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖3 陰性樣品溶液Fig.3 Negative sample solution

制備他克莫司軟膏樣品溶液分別于0、1、2、3、5、6、8、10 h 檢測 ,其峰面積沒有明顯的變化 ,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.49%,說明該樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 線性試驗(yàn)

取他克莫司對照品適量,用(正己烷-正丁基氯-乙腈1∶1∶1)混合溶液作為溶劑,配置成濃度分別為 2、5、10、50、70、100 、200 mg/L,按 1.3 項(xiàng)色譜條件依次分析各標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積(A)對進(jìn)樣量(μ g)得他克莫司的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為Y=2 600.7×-583.82,相關(guān)系數(shù)為0.999 9,線性范圍為2 mg/L～200 mg/L。

2.6 回收率試驗(yàn)

取他克莫司軟膏,稱取 9份,每份為0.5 g,每3份為1組,第一組加入他克莫司對照品0.4 mg,第二組加入0.5 mg,第三組加入0.6 mg到100 mL容量瓶中,按照1.3樣品溶液項(xiàng)方法處理,照1.2項(xiàng)色譜條件檢測,其平均回收率為 98.97%,RSD為0.47%。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取他克莫司對照品溶液進(jìn)行紫外掃描,在紫外波長225 nm有最大吸收,參考相關(guān)文獻(xiàn),選擇225 nm為檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇

因?yàn)楸酒窐O性較大,參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]考察了硅膠柱、氨基柱、二醇基柱、C18柱,最后在 Diol色譜柱上都有較好的保留和峰形,與雜質(zhì)能很好地分離,故選擇Diol色譜柱。

3.3 色譜條件的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn),考察了乙腈-異丙醇-磷酸,甲醇-異丙醇-磷酸,正己烷-正丁基氯-乙腈體系在不同比例下的分離效果,最后在正己烷∶正丁基氯∶乙腈=7∶2∶1體系中主峰峰形好,并且樣品與雜質(zhì)能很好的分離,柱溫的適當(dāng)變化對分離均沒有影響。

3.4 凈化條件的選擇

考察了硅膠小柱的不同規(guī)格,因?yàn)檐浉嗷w復(fù)雜,需要硅膠質(zhì)量較多,最后選擇了1 000 g/6L的規(guī)格;在淋洗時(shí),使用了多個(gè)體積的淋洗液,最后使用了5 mL,回收率高,揮干較快。

對該方法進(jìn)行考察驗(yàn)證時(shí),各項(xiàng)試驗(yàn)均滿足藥品含量測定檢測方法的驗(yàn)證要求,故該方法簡單可行,專屬性強(qiáng)。

本方法采用的高效液相色譜法[3,4]檢測他克莫司軟膏劑中主成分含量,簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可應(yīng)用于他克莫司軟膏劑的含量測定。

[1]許明哲,尹利輝,胡昌勤.HPLC法測定他克莫司軟膏含量及含量均勻度[J].中國抗生素雜志,2005,30(12):748-751.

[2]周明昊,姚彤煒.反相高效液相色譜法測定他克莫司軟膏含量[J].中國抗生素雜志,2007,10,32(10):615-617.

[3]顧吉晉,鄧英杰,王浩,等.RP-HPLC法測定大鼠血漿中姜黃素含量[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,4(4):241-244.

[4]李宏,趙波,劉靜,等.RP-HPLC測定川明參藥材中香豆素含量[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,5(2):122-125.