張菁華

(菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校,山東 菏澤 274000)

近年來(lái),我國(guó)肺癌的發(fā)病率及病死率已躍居惡性腫瘤首位。在癌癥的診治及預(yù)后中,iNOS受到廣泛關(guān)注。近期研究顯示,iNOS因促進(jìn)新生血管生成而有助于血管依賴(lài)的實(shí)體瘤的生長(zhǎng),其在肺癌中表達(dá)的研究也炙手可熱。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)16例肺癌組織標(biāo)本中iNOS的表達(dá),探討iNOS在肺癌中的表達(dá)意義及與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本組資料選取菏澤市立醫(yī)院病理科2010年6月～2010年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的肺癌患者的石蠟標(biāo)本16例,其中鱗癌8例,腺癌8例,所有病例均有完整的臨床資料?；颊咝g(shù)前均未行放療、化療及生物免疫治療,手術(shù)中取肺癌組織及淋巴結(jié)、正常肺組織[所切除肺距離病灶最遠(yuǎn)處(＞3 cm)的正常組織]。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)和TNM分期。

1.3 主要試劑

美國(guó)Santa Cruz公司制造生產(chǎn)的兔抗人iNOS多克隆抗體,美國(guó)Zymed公司生產(chǎn)制造的SP-streptavidin/per-oxidase kit,Sigma公司生產(chǎn)的考馬斯亮藍(lán) G-250染料、BSA、二巰基乙醇,德國(guó)羅氏公司生產(chǎn)的PVDF膜以及Pierce公司生產(chǎn)的ECL顯色液。

1.4 免疫組化染色

采用鏈霉菌抗生物素過(guò)氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,S-P)免疫組化法,按S-P試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。腫瘤組織切除后,立即取標(biāo)本,放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?biāo)本置于中性福爾馬林中固定,石蠟包埋,4 μ m厚度連續(xù)切片后供常規(guī)HE染色及SP法免疫組織化學(xué)染色。具體步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,PBS洗兩次各5 min,3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,室溫靜置10 min,PBS洗兩次各5 min,高壓鍋修復(fù)抗原,PBS洗兩次各5 min,滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,滴加 iNOS一抗,室溫靜置1 h,PBS洗 3次每次 2 min,滴加生物素標(biāo)記二抗,室溫靜置1 h,PBC洗3次每次5 min,DAB顯色試劑盒顯色10 min,PBS沖洗10 min,蘇木素復(fù)染2 min、鹽酸酒精分化,自來(lái)水沖洗10 min,脫水、透明、封片、鏡檢。對(duì)照染色,以陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照;以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 免疫組化結(jié)果判定及計(jì)數(shù)方法

iNOS的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。根據(jù)著色深淺程度及陽(yáng)性胞數(shù)的多少,對(duì)表達(dá)程度進(jìn)行半定量評(píng)估分級(jí),分別評(píng)為0～3分。即染色強(qiáng)度:陰性對(duì)照(0分);染色弱但明顯高于陰性對(duì)照(1分);染色清晰(2分);染色強(qiáng)(3分)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分;11%-25%為1分;26%-50%為2分;≥51%為3分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用χ2檢驗(yàn),t檢驗(yàn),直線相關(guān)分析,以P=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示肺癌組織中iNOS陽(yáng)性例數(shù)為10例,占總數(shù)的62.5%,其中腺癌和鱗癌陽(yáng)性例數(shù)分別為6例和4例(75.0%VS 50.0%),在癌旁正常組織中,iNOS的陽(yáng)性例數(shù)為1,陽(yáng)性率為6.3%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00),見(jiàn)表 1。

表1 iNOS在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of iNOS in lung cancer tissues and adjacent normal tissues

3 討論

惡性腫瘤與iNOS在不正常的生理相關(guān)濃度下產(chǎn)生高水平表達(dá)有關(guān)[1]。iNOS在健康人體組織中不表達(dá)或低表達(dá),而通常在炎癥或腫瘤等病理?xiàng)l件下誘生。iNOS為Ca2+非依賴(lài)性,在細(xì)胞因子及其他細(xì)胞毒性物質(zhì)的作用下產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)。NO是大多數(shù)組織中關(guān)鍵的第二信使,持續(xù)合適濃度的NO促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,過(guò)高濃度的NO則產(chǎn)生抗瘤效應(yīng)。iNOS誘導(dǎo)合成納摩爾(nmol)水平的NO,較正常生理?xiàng)l件下的 NO濃度約高1 000倍,但卻比引起細(xì)胞凋亡的活性低1-2個(gè)數(shù)量級(jí),所以iNOS誘導(dǎo)生成的NO在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中主要起促進(jìn)作用[2]。iNOS誘導(dǎo)生成的NO在NPC中可能起了關(guān)健性的作用[3]。

血管增生是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要的條件[4]。iNOS表達(dá)能影響腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),因此與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[5,6]。近年來(lái)研究表明,iNOS活性的增高與腫瘤血管生成有關(guān)[4],與本研究得出的肺癌組織中iNOS表達(dá)高于癌旁正常組織的結(jié)果一致。

表2 iNOS表達(dá)與各臨床病理特征間的關(guān)系Tab.2 Correlation of iNOS expression and clinical/pathological characteristics

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌中iNOS的表達(dá)與性別和年齡有關(guān)。在日常生活中,男性較女性、老年較青壯年更多接觸到煙霧環(huán)境。有研究證明,吸煙肺癌患者的iNOS較不吸煙患者的陽(yáng)性率高[7]。與本研究得出的男性患者肺癌組織中iNOS的陽(yáng)性率高于女性的結(jié)果一致。

本次研究結(jié)果提示,iNOS在肺癌細(xì)胞中高表達(dá),表明iNOS在一些惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

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