劉麗娜,潘渠,朱軍民,叢延廣,劉紅美,李程

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)教研室,貴州 貴陽(yáng) 550004;2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,重慶 400038;3.重慶市永榮礦務(wù)局總醫(yī)院病理科,重慶 402460)

豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)能引起豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、多關(guān)節(jié)炎、多漿膜炎、肺炎和突然死亡,是造成世界養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原之一。目前已知的35個(gè)血清型中,血清2型的致病力最強(qiáng)、流行范圍最廣,可感染人。1998年和2005年大規(guī)模爆發(fā)人感染2-型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件[1],迫使我們必須加強(qiáng)對(duì)SS2感染的預(yù)防和控制。實(shí)踐證明疫苗預(yù)防是消滅和控制傳染病的有效手段之一[2],但是迄今仍無(wú)有效預(yù)防SS2感染的疫苗。

表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制備的疫苗,包括合成肽疫苗、重組表位疫苗和表位核酸疫苗,是目前有關(guān)傳染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研制方向[3]。通常僅由一種抗原肽制備的疫苗,誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用較弱,含有多種B細(xì)胞或T細(xì)胞表位的多表位疫苗,可誘導(dǎo)更好的保護(hù)力。發(fā)展多表位疫苗有利于提供更完全更有針對(duì)性的免疫保護(hù)。另外,對(duì)抗原表位的研究,將深層次地揭示蛋白抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制。

筆者在前期研究工作中,證實(shí)了RTX家族胞外蛋白A(RTX family exoprotein A,RfeA)能提供小鼠抵抗SS2高致病力菌株致死性攻擊的保護(hù)力,是SS2新的保護(hù)性抗原[4],對(duì)RfeA的進(jìn)一步研究將有助于SS2疫苗的研制。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)RfeA的B細(xì)胞表位進(jìn)行分析和預(yù)測(cè),為開(kāi)展SS2多表位疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 SS2保護(hù)性抗原RfeA的氨基酸序列

SS2全基因組序列測(cè)定和推定氨基酸序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[5],RfeA含有186個(gè)氨基酸殘基。

1.2 SS2保護(hù)性抗原RfeA的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域預(yù)測(cè)

用Garnier-Robson法[6]、Chou-Fasman法[7]和Karplus-Schulz法[8]預(yù)測(cè)RfeA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域。

1.3 SS2保護(hù)性抗原RfeA的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

用Kyte-Doolittle法[9]分析 RfeA的親水性,用Emini法[10]預(yù)測(cè) RfeA的表面可能性,用 Jameson-Wolf法[11]預(yù)測(cè)RfeA的抗原性指數(shù),綜合分析上述各方法的預(yù)測(cè)結(jié)果,最終推測(cè)RfeA的B細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 RfeA蛋白預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域

按Garnier-Robson法預(yù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖1,按Chou-Fasman法預(yù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖2,按Karplus-Schulz法預(yù)測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖3,同時(shí)被3種方法預(yù)測(cè)為柔性結(jié)構(gòu)的區(qū)域很可能就是RfeA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域。綜合分析圖1、圖2和圖3,RfeA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域位于 N-端的第 6～8、32～35、54-58、67～ 69、74～ 76、112～ 115、152～ 155。

圖6 RfeA蛋白的抗原性指數(shù)Fig.6 Antigenicity index for RfeA

2.2 RfeA蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

采用 Kyte-Doolittle法、Emini法和 Jameson-Wolf法分別預(yù)測(cè)RfeA蛋白的親水性、表面可能性和抗原性指數(shù),結(jié)果見(jiàn)圖4-6。經(jīng)抗原性指數(shù)、蛋白質(zhì)表面可能性指數(shù)和親水性指數(shù)篩選出的氨基酸區(qū)段中(抗原性指數(shù)≥0,表面可能性指數(shù)≥1,親水性指數(shù)≥0),如果其內(nèi)部或附近又具有柔性結(jié)構(gòu),則很有可能為B細(xì)胞表位。綜合分析上述預(yù)測(cè)結(jié)果,RfeA 蛋白 N-端第 21～ 27、53-60、104～ 117、140～ 160 區(qū)段很有可能存在B細(xì)胞表位。

3 討論

表位的鑒定是構(gòu)建表位疫苗的第一步。目前有多種方法用于抗原表位的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和理論預(yù)測(cè),如根據(jù)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法、化學(xué)“切割”法或酶法、肽探針掃描技術(shù)(交疊合成多肽的方法)、噬菌體展示技術(shù)、Ag-Fab復(fù)合物的X射線衍射和核磁共振(NM R)分析等[12]。根據(jù)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法具有簡(jiǎn)單、直觀、快速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于疫苗研究[13-15]。因此,本研究采用蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位。

有效的保護(hù)免疫取決于一組表位的合理組合與搭配?？乖砦弧⑦B接方法、表達(dá)系統(tǒng)以及表位的加工效率都會(huì)影響到多表位疫苗的免疫效力,而且在設(shè)計(jì)表位疫苗時(shí),還應(yīng)根據(jù)機(jī)體對(duì)疾病的免疫應(yīng)答特點(diǎn)及免疫保護(hù)機(jī)制,合理選擇特異性B細(xì)胞表位、Th表位或CTL表位來(lái)定向誘導(dǎo)宿主的B細(xì)胞應(yīng)答、Th應(yīng)答或CTL應(yīng)答,或者采用多種類型的表位組合,同時(shí)誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫[12]。在前期的研究工作中,我們證實(shí)了RfeA能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,以體液免疫為主,能有效保護(hù)小鼠免受SS2高致病力菌株的致死性攻擊[4]。因此,在設(shè)計(jì)以RfeA為基礎(chǔ)的多表位疫苗時(shí),選擇特異性B細(xì)胞表位,定向誘導(dǎo)宿主的B細(xì)胞應(yīng)答。

通常蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的表位分布有較大關(guān)系。轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域的結(jié)構(gòu)比較松散,易于發(fā)生扭曲、盤旋,并展示在蛋白分子表面,成為抗原表位的可能性較大。此外,蛋白質(zhì)分子的親水性、表面可能性、柔韌性和抗原性等也與其抗原表位構(gòu)成有密切的聯(lián)系。因此,本研究將蛋白親水性、表面可能性以及抗原指數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域的分析相結(jié)合,綜合判定含有B細(xì)胞表位的區(qū)段。通常使用單一方法和參數(shù)進(jìn)行抗原表位的預(yù)測(cè)正確率不高,一般將多種方法和多參數(shù)分析的結(jié)果進(jìn)行綜合,這樣可提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可信性。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了RfeA的B細(xì)胞表位,為設(shè)計(jì)SS2的多表位疫苗和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證疫苗免疫效力奠定了基礎(chǔ)。

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